黃芩苷對動脈粥樣硬化大鼠血漿TAFI及hs-CRP、IL-6水平的影響

顧瓊瓊 劉向群 王 敏 于 昕 (山東大學(xué)齊魯醫(yī)院干部保健科，山東 濟南 250012)

動脈粥樣硬化(AS)及其并發(fā)癥是心腦血管疾病的重要病理生理基礎(chǔ)，發(fā)病機制復(fù)雜。近年來的研究顯示，AS是一種多因素疾病，炎癥貫穿于動脈硬化發(fā)展的整個過程，是動脈硬化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，炎癥因子在AS發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要作用〔1，2〕。黃芩苷是中藥黃芩的主要有效成分，具有抗炎、抑制血管平滑肌的增殖 、脂氧化酶及抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用，從理論上來講其可作為預(yù)防AS的有效天然藥物應(yīng)用。本研究通過觀察黃芩苷對AS大鼠血漿凝血酶激活的纖溶抑制物(TAFI)、高敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及白介素(IL)-6水平的影響，探討黃芩苷在干預(yù)AS發(fā)生發(fā)展過程中的機制。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器 健康雄性的Wistar大鼠，8周齡，體重300～400 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供。黃芩苷:黃色粉末，購自四川協(xié)力制藥有限公司，批號:國藥準(zhǔn)字20053191，相對分子質(zhì)量為446.35，臨用時用生理鹽水配制成25 mg/ml，于棕色容器中密閉儲存。酶標(biāo)儀:山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室提供(Model 550型，美國 BIO-RAD公司生產(chǎn))。大鼠hs-CRP、IL-6酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)試劑盒購自美國R＆D公司。TAFI發(fā)色底物試劑盒為美國DIAGNOSTICA公司生產(chǎn)，購自上海船夫生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高脂飲食配制方法 按照3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%白糖、10%豬油、5%蛋黃粉、76.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料比例配制。

1.2.2 動物模型制備及給藥方法 采用高脂飲食+主動脈內(nèi)皮球囊損傷+VD3注射方法建立大鼠AS模型。健康雄性的Wistar大鼠40只，先用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后隨機分配到假手術(shù)組、模型組、黃芩苷高、低劑量組，每組10只。假手術(shù)組大鼠在實驗開始第7天行假主動脈內(nèi)皮球囊損傷術(shù)，模型組、黃芩苷高、低劑量組大鼠在實驗開始7 d后給予主動脈內(nèi)皮球囊損傷術(shù)。然后假手術(shù)組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng);其余3組用高脂飼料喂養(yǎng)(15～25 g/d)，與此同時，在實驗開始時右下肢肌肉注射維生素D3針劑(30萬U/kg)，每隔30天重復(fù)1次。給藥方法:適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水5 ml灌胃，每天1次;黃芩苷高劑量組給予黃芩苷100 mg·kg－1·d－1灌胃，每天 1 次;黃芩苷低劑量組給予黃芩苷50 mg·kg－1·d－1灌胃，每天 1 次。

1.3 TAFI活性的測定 采用美國DIAGNOSTICA公司生產(chǎn)的TAFI ELISA試劑盒，經(jīng)美國產(chǎn)BIO-RAD Model550型全自動酶標(biāo)儀測定，采用發(fā)色底物法，步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

1.4 hs-CRP和IL-6活性測定 hs-CRP和IL-6活性測定試劑盒購于美國R＆D公司，由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室提供的美國BIO-RAD Model550型全自動酶標(biāo)儀進行檢測，均采用酶聯(lián)免疫吸附法，步驟嚴(yán)格按照說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 實驗4月后各組大鼠血漿TAFI、hs-CRP及IL-6的比較 與假手術(shù)組比較，模型組、黃芩苷高劑量組和黃芩苷低劑量組的TAFI、hs-CRP及IL-6水平明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，黃芩苷高低劑量組TAFI、hs-CRP及IL-6水平均明顯降低(P＜0.01或P＜0.05);黃芩苷高低劑量組間比較，高劑量組hs-CRP和IL-6水平明顯低于低劑量組(P＜0.05)，TAFI水平則無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。見表1。

2.2 TAFI水平與hs-CRP、IL-6的相關(guān)性分析 將全部研究對象作為一個整體，對TAFI活性水平與hs-CRP、IL-6進行直線相關(guān)分析，結(jié)果顯示，在大鼠AS發(fā)展過程中，TAFI活性水平與hs-CRP、IL-6均呈正相關(guān)(r分別為 0.278、0.547，P ＜0.01 或P＜0.05)。

表1 實驗4個月后不同組間TAFI水平及hs-CRP、IL-6的比較(± s，n=10)

表1 實驗4個月后不同組間TAFI水平及hs-CRP、IL-6的比較(± s，n=10)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與黃芩苷高劑量組比較:4)P＜0.05

組別 hs-CRP(ng/L) IL-6(ng/L) TAFI(mg/L)假手術(shù)組85.66±10.73 38.95±1.99 29.5±0.05模型組 169.16±11.531) 76.24±4.321) 36.8±4.571)黃芩苷高劑量組 97.27±6.891)2) 42.41±1.591)2) 32.7±2.361)3)黃芩苷低劑量組 109.21±8.511)2)4)53.67±2.21)2)4) 31.3±1.571)3)

3 討論

郭延松〔3〕等綜合脂質(zhì)浸潤學(xué)說、鈣超載學(xué)說、內(nèi)皮損傷學(xué)說、血栓形成學(xué)說等理論，成功地建立了大鼠AS模型。他們發(fā)現(xiàn)，大鼠可作為研究AS的良好動物模型，高脂飲食+主動脈內(nèi)皮球囊損傷+VD3負荷可形成較成熟的AS斑塊。本課題組劉利妍等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用高脂飲食+主動脈內(nèi)皮球囊損傷+VD3負荷的方法喂養(yǎng)大鼠4個月，可成功復(fù)制AS模型。也就是說用高脂飲食+主動脈內(nèi)皮球囊損傷+VD3負荷的方法復(fù)制AS模型是成熟可靠的。

Tregouet等〔5〕研究認(rèn)為，活化的TAFI是冠心病患者遠期心血管病事件危險性的獨立預(yù)測因素。Schroeder等〔6〕對冠狀動脈疾病患者和對照組的研究發(fā)現(xiàn)，冠心病患者的靜脈和冠狀動脈的TAFI水平比對照組升高，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，而且TAFI水平與總膽固醇、纖維蛋白水平和急性期反應(yīng)物水平具有相關(guān)性，提示在冠心病患者體內(nèi)TAFI參與炎癥的調(diào)節(jié)。劉利妍等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，在AS發(fā)展過程中，隨著AS病變的加重，TAFI水平逐漸升高，并且與TG、TC水平呈正相關(guān)，說明TAFI參與AS的形成。本研究顯示TAFI在AS進展過程中發(fā)揮了重要作用。

C反應(yīng)蛋白(CRP)主要在 IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-1等炎性遞質(zhì)調(diào)節(jié)下由肝細胞合成，不僅是反映炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，其本身還有炎癥因子的作用，直接參與AS的形成和發(fā)展〔7〕，可以促進單核細胞向血管壁的黏附、下調(diào)內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶和前列環(huán)素的合成、激活內(nèi)皮細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、促進平滑肌細胞的遷移增生和膠原降解。尤其是近年來hs-CRP檢測技術(shù)得到應(yīng)用，可準(zhǔn)確測定低濃度 CRP(0.15～10.00 mg/L)，hs-CRP作為炎癥標(biāo)志物被認(rèn)為是心血管事件危險性最強有力的預(yù)測因子。高水平的hs-CRP還可通過促進纖溶酶原激活物抑制因子表達與纖維蛋白原一起參與血栓形成〔8〕，而且有臨床研究表明，C-反應(yīng)蛋白與血漿TAFI濃度成正相關(guān)〔9〕。本研究亦顯示，在AS大鼠模型中，TAFI活性水平升高，與hs-CRP、IL-6均呈正相關(guān)。

IL-6與CHD的發(fā)生、發(fā)展存在一定的關(guān)系，Choussat等〔10〕研究表明，IL-6作為炎癥細胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，促進激活的巨噬細胞分化和浸潤，還可以上調(diào)黏附分子和其他細胞因子的表達，從而加強炎癥反應(yīng)。Aydin等〔11〕研究認(rèn)為，冠心病患者的血清中炎性細胞因子如IL-6、TNF-α的水平顯著升高。另有臨床研究證實〔12〕，IL-6在CHD患者循環(huán)水平顯著高于正常人群，而且血清IL-6水平的改變對日后發(fā)生的冠脈事件具有預(yù)測價值。

Ross發(fā)現(xiàn)〔1〕當(dāng)炎癥反應(yīng)引起內(nèi)皮損傷時，hs-CRP在IL-6調(diào)節(jié)下由肝細胞合成，前者通過激活補體系統(tǒng)引起脂質(zhì)沉積，此時hs-CRP明顯升高。CRP在轉(zhuǎn)錄水平上由IL-6調(diào)節(jié)合成，CRP的升高是體內(nèi)“瀑布式”炎癥反應(yīng)中的一個環(huán)節(jié)，反過來可刺激IL-6的合成，形成CRP與IL-6之間的惡性循環(huán)。而且，IL-6還可以通過影響CPB2 mRNA的穩(wěn)定性使其濃度降低，進而下調(diào)TAFI的表達〔13〕。本研究顯示，應(yīng)用黃芩苷干預(yù)動脈粥樣硬化大鼠后，血漿IL-6、hs-CRP水平明顯下降，其機制可能為IL-6水平降低，進而在轉(zhuǎn)錄水平上使hs-CRP表達下調(diào)，起到了在炎癥層面干預(yù)動脈粥樣硬化的作用。

黃芩苷的心血管保護作用主要有抗炎、清除氧自由基、抗缺血再灌注損傷等。在本研究中，在AS模型組應(yīng)用黃芩苷干預(yù)后hs-CRP、IL-6水平明顯降低，而以往的研究表明hs-CRP、IL-6水平與AS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)聯(lián)〔7，11〕，提示黃芩苷有抗AS炎癥過程的作用，可預(yù)防AS的發(fā)生和發(fā)展。黃芩苷干預(yù)后TAFI水平降低，可以恢復(fù)機體的凝血纖溶系統(tǒng)之間的精細平衡，進而減少纖維蛋白沉積〔14〕。而且TAFI水平和hs-CRP、IL-6水平成正相關(guān)，黃芩苷可能通過降低AS過程中炎癥因子的表達進而降低TAFI的表達，恢復(fù)凝血纖溶系統(tǒng)之間的精細平衡來干預(yù)AS的發(fā)生發(fā)展。

黃芩苷作為一種天然藥物，具有毒性低、副作用小等優(yōu)點，有待進一步深入的基礎(chǔ)實驗研究和大規(guī)模的臨床試驗研究來進一步證實其在起始階段防治AS中的作用機理及臨床應(yīng)用價值，為臨床AS及其相關(guān)疾病的防治開辟新的途徑。

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