姜黃素對腦缺血再灌注模型大鼠的神經保護作用及其機制

徐 芳 魏桂榮

徐 芳,魏桂榮

湖北省襄陽市中心醫院神經科,襄陽441021

腦缺血再灌注(Ischemia and Reperfusion,I/R)是腦組織損傷的重要機制,既往研究發現,腦缺血可誘導基質金屬蛋白酶-9(Matrix Met-alloproteinase,MMP-9)表達,通過促進細胞外基質(Extracellular Matrix,ECM)降解和再灌注后血腦屏障開放,引起腦出血、腦水腫和白細胞浸潤,最終導致神經功能損傷[1]。姜黃素是一種多酚類化合物,具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤效應[2]。本研究通過動態觀察大鼠I/R及姜黃素處理對血腦屏障通透性和MMP-9表達的影響,探討姜黃素的腦保護作用及可能機制,為臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

姜黃素、伊文思藍(EB)購自美國Sigma公司,兔抗鼠MMP-9單抗購自美國Santa Cruz公司,其余試劑為國產分析純。

1.2 實驗動物及分組處理

雄性SD大鼠,體重180～250g,購自華中科技大學統計醫學院實驗動物中心。隨機分為3組(n均=6):假手術組、腦I/R模型組(模型組)和姜黃素組。模型組大鼠參照Longa等[3]報道的線栓法加以改進,建立局灶性腦I/R模型,栓線采用尼龍魚線,直徑0.26～0.28mm,長4.0cm。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,仰臥固定大鼠,分離并暴露左側頸總及頸內、外動脈,尼龍魚線從頸外動脈至頸內動脈插入大腦中動脈遇阻即止,進線長度18～20mm,栓塞成功的大鼠在缺血后2h拔除尼龍魚線至頸外動脈殘端內,恢復血流灌注。假手術組大鼠術后插入線栓深度為10mm,不形成栓塞。姜黃素組在缺血前1h腹腔注射姜黃素200mg/kg,隨后每12h腹腔注射姜黃素60mg/kg,共5次。各組大鼠于再灌注后3h、24h、72h測定腦組織含水量和EB含量。之后斷頭取腦,迅速液氮保存備檢MMP-9。

1.3 腦組織含水量測定

參照Xiao等[4]的方法進行。根據下列公式計算腦組織含水量:腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.4 腦組織EB含量測定

按照Ikede等[5]的方法進行腦組織EB含量測定。

1.5 MMP-9表達水平測定

各組大鼠斷頭取腦,取視交叉前后腦組織,勻漿,免疫印跡法檢測MMP-9表達水平。

1.6 統計學處理

用SPSS13.0統計學軟件進行統計學處理,各組數據用均數±標準差(±s)表示,兩組均數比較用t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 姜黃素對腦I/R損傷后大鼠腦組織含水量的影響

模型組大鼠再灌注后各時間點腦組織含水量明顯增加,與假手術組比較,差異有統計學意義(P＜0.01),而姜黃素組腦組織含水量較模型組明顯減少(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠腦組織含水量比較(%,±s,n均=6)

表1 各組大鼠腦組織含水量比較(%,±s,n均=6)

注:與假手術組比較,1)P＜0.01,與模型組比較,2)P＜0.01

時間 假手術組 模型組 姜黃素組3h 76.14±4.32 89.36±2.651) 82.45±2.142)24h 75.63±2.15 86.25±4.821) 80.35±3.522)72h 76.28±3.24 85.41±3.651) 79.32±1.972)

2.2 姜黃素對腦I/R損傷后大鼠腦組織EB含量的影響

模型組大鼠腦組織EB含量與假手術組比較明顯增加(P＜0.01),而姜黃素組大鼠腦組織EB含量較模型組明顯減少(P＜0.01)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織EB含量比較(μg/g組織,±s,n均=6)

表2 各組大鼠腦組織EB含量比較(μg/g組織,±s,n均=6)

注:與假手術組比較,1)P＜0.01,與模型組比較,2)P＜0.01

時間 假手術組 模型組 姜黃素組3h 1.62±0.04 3.96±0.0551) 2.23±0.042)24h 1.58±0.04 3.75±0.041) 2.13±0.032)72h 1.62±0.03 3.59±0.051) 2.05±0.032)

2.3 姜黃素對腦I/R損傷后大鼠腦組織MMP-9表達的影響

假手術組未見MMP-9的表達,模型組腦組織MMP-9表達水平顯著增高,而姜黃素組MMP-9表達水平明顯低于相同時間點的模型組。見圖1。

圖1 姜黃素對大鼠腦I/R損傷后MMP-9表達的影響

3 討 論

腦I/R損傷是腦血管病神經損傷的重要機制,缺血腦組織恢復血流后神經損傷反而加重,其機制非常復雜,主要涉及氧利用障礙、炎癥反應、鈣超載等,因此研究其機制并尋找針對性的干預方法具有非常重要的意義。血腦屏障通透性增加,一方面加重腦水腫,另一方面有利于炎癥因子和炎性細胞通過血腦屏障,促進炎癥反應和細胞凋亡[6]。因此,降低血腦屏障通透性進而減輕I/R損傷,是臨床治療目的之一。

EB是小分子指示劑,與血漿蛋白結合后,不能通過血腦屏障,只有當血腦屏障破壞時才進入腦組織,可作為評估血腦屏障損傷的定性指標。本文檢測大鼠腦組織內EB含量時發現,I/R后3h至72h,模型組大鼠腦組織內EB含量明顯高于假手術組,表明此時大鼠腦組織內血漿蛋白外滲,血腦屏障的通透性增加,且與腦組織含水量檢測結果相吻合,提示再灌注損傷后血腦屏障損傷明顯。而姜黃素組大鼠腦組織內EB含量和腦組織含水量低于模型組,表明姜黃素對腦缺血后血腦屏障具有保護作用。

既往研究表明,MMP-9在缺血腦損傷中起重要作用。缺血后腦組織MMP-9活性增加是缺血后血腦屏障損傷和加重缺血性腦損傷的重要機制之一[7,8]。本研究結果提示姜黃素的神經保護作用至少部分是通過抑制MMP-9的表達實現的。

綜上所述,腦I/R損傷與MMP-9破壞血腦屏障關系密切,因此早期合理有效調節MMP-9,有望成為臨床上防治血腦屏障損傷和血管源性腦水腫形成的有效方法。姜黃素可通過降低血腦屏障通透性、抑制MMP-9表達而發揮其對腦I/R損傷的保護作用,具有較好的臨床應用前景。

1 Zhao BQ,Wang S,Kim HY,et al.Role of matrix metalloproteinases in delayed cortical responses after stroke.NaTMed,2006,12(4):441～445.

2 Awasthi H,Tota S,Hanif K,et al.Protectiveeffect of curcumin against intracerebral streptozotocin induced impairment in memory and cerebral blood flow.Life Sci,2010,86(3～4):87～ 94.

3 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats.Stroke,1998,29(8):671～678.

4 Xiao F,Zhang Z,Arnold TC,et al.Mild hy pothermia induced before cardiac arrest reduces brain edema formation in rats.Acad Emerg Med,2002,9(2):105～114.

5 Ikede Y,Wang M,Nakazawa S.Simple quantitative evaluation of blood brain barrier disruption in vasogenic brain edama.Acta Neurochir,1994,60(Suppl):119～120.

6 Asahi M,Wang XY,Mori T,et al.Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-outon the proteoly sis of blood-brain barrier and white matter components after cerebral ischemia.J Neurosci,2001,21(19):7 724～7 732.

7 Kamada H,Yu F,Nito C,et al.Influence of hyperglycemia on oxidative stress and matrix metalloproteinase-9 activation after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats:relation to bloodbrain barrier dysfunction.Stroke,2007,38(3):1 044～1 049.

8 Barr TL,Latour LL,Lee KY,et al.Blood-brain barrier disruption in humans isindependently associated with increased matrix metalloproteinase-9.Stroke,2010,41(3):e123～128.