紅霉素對白介素-4誘導人支氣管上皮細胞表達白介素-6及還原型谷胱甘肽的影響研究

蔡小軍，俞云，陸一，葉建林，岳林峰（.江蘇無錫市人民醫(yī)院藥劑科，無錫市403；.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，南京市 009）

支氣管哮喘是由多種炎性細胞參與的慢性變態(tài)反應性疾病。人支氣管上皮細胞（HBE）是炎癥反應的主要靶細胞，在支氣管哮喘炎癥修復中起關鍵作用，亦是治療呼吸系統(tǒng)疾病藥物的主要作用細胞[1]。哮喘的免疫學發(fā)病機制主要是通過T輔助細胞1（Th1）/T輔助細胞2（Th2）反應的失衡導致免疫球蛋白E（IgE）合成增加，直接或間接誘導肥大細胞、嗜酸性粒細胞脫顆粒產(chǎn)生氣道高反應及炎癥。白介素（IL）-4是目前所知最強的IgE調(diào)節(jié)因子，可促進IgE生成，從而介導哮喘的發(fā)生與發(fā)展[2]。紅霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、嗜肺軍團菌、支原體等均有抗菌作用，常用于對青霉素耐藥的革蘭陽性菌感染及對青霉素過敏的患者。紅霉素臨床首選用于嗜肺軍團菌肺炎、支原體肺炎、沙眼衣原體所致的嬰兒肺炎及結腸炎；也可用于扁桃體炎、中耳炎、鼻竇炎、大葉性肺炎等。已有研究[3]證實，長期應用小劑量大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以抑制炎癥細胞釋放炎癥介質(zhì)和抗氧化應激，從而保護HBE，減弱肺部的炎癥反應。筆者結合哮喘的發(fā)病機制，采用IL-4誘導HBE損傷建立模型，觀察紅霉素對HBE細胞活力及其釋放IL-6與主要抗氧化物質(zhì)還原型谷胱甘肽（GSH）的影響，探討紅霉素治療哮喘的可能機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FORMA3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；超凈工作臺（蘇州百神科技網(wǎng)絡系統(tǒng)有限公司）；倒置相差顯微鏡（德國Leica Dmil公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Thermo Labsystems公司）。

1.2 試藥

紅霉素原料藥（美國Sigma公司，批號：B1001021，純度：≥98%）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）（美國Merck公司）；IL-4原料藥（美國Peprotech公司，批號：200-04）；IL-6檢測試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：ZJAFBZZH02）；GSH檢測試劑盒（美國Cayman公司，批號：100106）；MTT（瑞士Fluka公司）。

1.3 細胞株

正常HBE細胞（16-HBE細胞株），購自湖南遠泰生物技術有限公司。

2 方法

2.1 MTT溶液的制備

取MTT 50 mg，溶于10 mL磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌10 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾器除菌，4℃避光保存，備用。

2.2 分組與給藥

取HBE細胞，置于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的HBE細胞，0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基制備成單個細胞懸液，以每孔104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔80 μL細胞懸液。按正常對照組（生理鹽水20 μL）、IL-4組（IL-4（0.01 μg·mL－1）10 μL，生理鹽水10 μL）、紅霉素低、高劑量組（IL-4（0.01 μg·mL－1）10 μL，紅霉素（5、50 μg·mL－1）10 μL），加入相應藥物，每組8個復孔，混勻后，在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中分別孵育24、48 h。試驗重復3次。

2.3 細胞活力的檢測

將細胞分別連續(xù)孵育24、48 h后，取出，每孔加入新鮮制備的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，然后每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使結晶物充分溶解后立即置于酶聯(lián)免疫檢測儀，于490 nm波長處測定各組的吸光度值（OD）。OD值越大，細胞活力越大。

2.4 細胞內(nèi)IL-6釋放量的檢測

取“2.3”項下培養(yǎng)的上清液以雙抗體夾心法檢測每組細胞IL-6的釋放量，具體步驟按IL-6檢測試劑盒說明書操作。

2.5 細胞內(nèi)GSH水平的檢測

取孵育24、48 h后的細胞懸液，按GSH檢測試劑盒說明書操作檢測其中GSH水平。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 細胞活力比較

與正常對照組比較，IL-4組細胞孵育24、48 h后活力明顯降低（P＜0.01）。與IL-4組比較，紅霉素低、高劑量組細胞孵育48 h后活力明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），結果見表1。

表1 各組細胞活力比較（OD值，±s，n＝8）Tab 1 Comparison of human bronchial epithelial cells activity in each grou（pOD，±s，n＝8）

表1 各組細胞活力比較（OD值，±s，n＝8）Tab 1 Comparison of human bronchial epithelial cells activity in each grou（pOD，±s，n＝8）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與IL-4組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.IL-4 group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組IL-4組紅霉素低劑量組紅霉素高劑量組48 h 0.866 0±0.083 2 0.654 3±0.057 0＊0.709 1±0.064 5#0.768 2±0.061 9##24 h 0.516 7±0.023 7 0.447 2±0.020 1＊0.452 3±0.026 6 0.468 2±0.026 0

3.2 細胞內(nèi)IL-6釋放量比較

與正常對照組比較，IL-4組細胞孵育24、48 h后IL-6釋放量明顯升高（P＜0.01）。與IL-4組比較，紅霉素高劑量組細胞孵育24、48 h后IL-6釋放量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），紅霉素低劑量組僅孵育48 h后IL-6釋放量明顯降低（P＜0.05），結果見表2。

表2 各組細胞中IL-6釋放量比較（pg·mL－l，±s，n＝8）Tab 2 Comparison of IL-6 expression in human bronchial epithelial cells in each grou（ppg·mL－l，±s，n＝8）

表2 各組細胞中IL-6釋放量比較（pg·mL－l，±s，n＝8）Tab 2 Comparison of IL-6 expression in human bronchial epithelial cells in each grou（ppg·mL－l，±s，n＝8）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與IL-4組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.IL-4 group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組IL-4組紅霉素低劑量組紅霉素高劑量組48 h 78.75±11.62 440.21±16.23＊264.96±12.81#169.78±10.68##24 h 59.18±5.53 343.75±12.23＊261.96±13.02 187.21±8.26#

3.3 細胞內(nèi)GSH水平比較

與正常對照組比較，IL-4組細胞孵育24、48 h后GSH水平明顯升高（P＜0.05）。與IL-4組比較，紅霉素低、高劑量組細胞孵育48 h后GSH水平明顯降低（P＜0.05），結果見表3。

表3 各組細胞中GSH水平比較（μmol·mg－l，±s，n＝8）Tab 3Comparison of GSH levels in each grou（pμmol·mg－l，±s，n＝8）

表3 各組細胞中GSH水平比較（μmol·mg－l，±s，n＝8）Tab 3Comparison of GSH levels in each grou（pμmol·mg－l，±s，n＝8）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與IL-4組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.IL-4 group：#P＜0.05

組別正常對照組IL-4組紅霉素低劑量組紅霉素高劑量組48 h 1.70±0.26 2.44±0.29＊2.03±0.25#1.89±0.30#24 h 1.60±0.23 2.38±0.35＊2.34±0.26 2.29±0.22

4 討論

本研究結果表明，體外培養(yǎng)的細胞經(jīng)0.01 μg·mL－1IL-4分別刺激24、48 h后活力明顯減少，IL-6釋放增加。紅霉素孵育48 h能明顯改善HBE細胞活力，抑制IL-6的釋放。

正常機體內(nèi)存在著氧化/抗氧化平衡調(diào)節(jié)體系。GSH是含有巰基的非蛋白三肽，其在保持HBE完整性、抵御氧化應激方面起著重要的作用。當氧化負荷增加時，一方面刺激了體內(nèi)炎癥介質(zhì)的表達而進一步加重了氧化負荷，同時促進了體內(nèi)保護性抗氧化基因GSH等的代償性表達，使體內(nèi)氧化/抗氧化達到新的平衡。當過量氧化劑導致氧化應激時，氧化/抗氧化平衡被破壞，刺激肺部炎癥并最終發(fā)展成哮喘。本試驗結果顯示，IL-4組細胞內(nèi)GSH水平明顯升高，提示在IL-4導致氧化應激后，細胞內(nèi)GSH會反饋性上調(diào)，形成了抗氧化應激的適應性或保護性反應。紅霉素作用24 h時細胞內(nèi)GSH水平無明顯變化，作用48 h后GSH水平明顯降低，表明紅霉素并不能直接上調(diào)GSH的合成，反而在一定程度上通過某種間接的途徑抑制了IL-4對GSH合成的刺激作用。這可能與紅霉素抑制IL-4誘導HBE炎癥介質(zhì)IL-6的釋放、減輕細胞內(nèi)炎癥負荷后機體反饋調(diào)節(jié)刺激GSH限速酶谷氨酰半胱氨酸合成酶作用減弱有關。此結果也可以部分解釋了臨床上為什么需要長期應用小劑量紅霉素治療哮喘才能取得較好治療效果的原因。本研究為更合理地應用紅霉素治療哮喘等慢性氣道炎癥性疾病提供了試驗依據(jù)，但其具體作用機制尚待深入探討。

[1] Lloyd CM，Hessel EM.Functions of T cells in asthma：more than just Th2cells[J].Nat Rev Immunol，2010，10（12）：838.

[2] Chiba Y，Goto K，Momata M，et al.Inducion of RhoA gene expression by interleukin-4 in cultured human bronchial smooth muscle cells[J].J Smooth Muscle Res，2010，46（4）：217.

[3] 何志義，鄒朝霞，于 亮，等.紅霉素對過氧化氫刺激的支氣管上皮細胞表達白介素-8與谷胱甘肽的影響[J].中華醫(yī)學雜志，2005，85（14）：976.