銅綠假單胞菌生物被膜誘導肺泡上皮細胞分泌炎性細胞因子的研究

王 非 王 媛 趙 瑋 駱仙芳 浙江中醫藥大學附屬第一醫院 杭州 310006

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）是引起多臟器醫院感染的常見病原菌之一，能形成生物被膜，易在慢性支氣管炎、支氣管擴張等原有肺部慢性病變基礎上引起肺部反復感染并纖維化[1]。有證據顯示，銅綠假單胞菌生物被膜可能是引起該菌感染引起肺纖維的化主要因素[2-3]。然而，銅綠假單胞菌生物被膜如何誘導肺纖維化機制不明。我們采用銅綠假單胞菌生物被膜作用人肺上皮細胞，檢測其分泌炎癥細胞因子的情況，探討銅綠假單胞菌生物被膜在感染性纖維化中作用，以期為闡明銅綠假單胞菌生物被膜誘導的感染性肺纖維化提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源及培養 銅綠假單胞菌ATCC27853株購自北京中國藥品生物制品檢定所。將細菌接種于LB瓊脂平板上（Sigma），挑取單個菌落接種至 5mL LB培養液中，37℃、210r/min旋轉培養12～16h。取lmL菌液10 000r/min離心 3min，取沉淀用0.01mol/L PBS（pH7.4）洗滌、離心2次。細菌沉淀用 lmL PBS重懸，經麥氏比濁法測定菌液濃度后用PBS配制成5×108CFU/mL菌液。

1.2. 細胞株及培養 人肺上皮細胞株A549購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。上述細胞培養于含10%胎牛血清（FCS，GiBco）、100 U/mL青霉素（Sigma）、100 U/mL鏈霉素（Sigma）的DMEM（GiBco）培養基中，37℃、5%CO2條件下培養2～3 天傳代。

1.3 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽的純化 銅綠假單胞菌ATCC27853株接種在LB瓊脂平板上，37℃培養7天。刮取培養物懸于PBS中，17 000r/min，4℃離心30min，上清液用花板0.22μm濾膜過濾去除殘留菌體，100℃水浴30min使蛋白變性，17 000r/min，4℃離心30min，用80%的乙醇將其中的藻酸鹽沉淀。藻酸鹽粗提物溶解于含有10mM的MgCL2和1mM的CaCL2的PBS中，加入100μg/mL RNase A（Sigma）和100μg/mL Type IV DNase I （Sigma），37℃作用4h，水解其中的RNA和DNA，然后于80℃加熱30min，使酶變性。17 000r/min、25℃離心30min后，上清液再用80%的乙醇沉淀。沉淀物用0.025M的碳酸銨溶解后加到DEAE-TOYO-PEARAL 650S（Tosoh）層析柱上并用0.025M到1.0M的碳酸銨溶液洗脫，洗脫的組分（每試管5mL）用卡巴唑-硼酸法測定其中的藻酸鹽含量。收集藻酸鹽含量≥100μg/mL 試管中的洗脫液，PBS中透析48h，更換PBS 3次，得到的藻酸鹽再與AFFI-Preppolymyxin（Bio-Rad）混合攪拌24h，17 000r/min，25℃離心30 min，棄含脂多糖AFFIPreppolymyxin沉淀，取上清真空旋轉干燥。

1.4 炎性細胞因子檢測 96孔細胞培養板中每孔接種1×104A549細胞，37℃、5%CO2條件下培養12h使成單層細胞。參考文獻及預實驗結果分別用懸浮于無抗生素2.5%FCS DMEM銅綠假單胞菌生物被膜 鹽（10 μg/mL）感染各細胞，37℃，5%CO2繼續培養，3、6、12、24、48 h收集上清，用細胞因子ELISA定量檢測試劑盒（RapidBio Lab）檢測白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子（TNF-α）表達量。不同作用時間均重復3孔。實驗中用非感染正常細胞作為對照（2.5%FCS DMEM）。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件分析處理數據，所得結果用（±s）表示。采用t檢驗，方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽誘導A549細胞分泌IL-1β的作用 受銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽作用12h后，A549細胞分泌IL-1β水平開始增高，并在48h內持續升高，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 藻酸鹽作用后A549細胞上清中IL-1β的濃度變化（± s） pg/mL

表1 藻酸鹽作用后A549細胞上清中IL-1β的濃度變化（± s） pg/mL

注：與空白對照組比較：△P＜0.05

組 別 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸鹽組(10μg/mL) 3 66.8±6.9 66.2±7.1 150.6±13.3△ 185.1±15.1△ 256.8±18.8△空白對照組（2.5%FCS DMEM） 3 67.1±7.6 67.4±6.3 68.8±7.2 71.0±8.1 70.4±7.6

2.2 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽誘導A549細胞分泌IL-6的作用 受銅綠假單胞生物被膜藻酸鹽作用6h后，A549細胞分泌IL-6的表達量開始增高，至24h達到高峰，此后開始下降，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 藻酸鹽作用后A549細胞上清中IL-6的濃度變化（± s） pg/mL

表2 藻酸鹽作用后A549細胞上清中IL-6的濃度變化（± s） pg/mL

注：與空白對照組比較：△P＜0.05

組 別 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸鹽組(10μg/mL) 3 53.6±7.3 136.1±14.4△ 171.5±14.8△ 205.1±24.2△ 176.8±17.6△空白對照組（2.5%FCS DMEM） 3 56.2±8.6 57.4±9.2 54.8±8.2 61.0±8.1 60.4±8.6

2.3 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽誘導A549細胞分泌IL-8的作用 受銅綠假單胞生物被膜藻酸鹽作用12h后，A54細胞分泌IL-8的量開始增高，24h達到高峰，此后有所下降，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 藻酸鹽作用后A549細胞上清中IL-8的濃度變化（± s） pg/mL

表3 藻酸鹽作用后A549細胞上清中IL-8的濃度變化（± s） pg/mL

注：與空白對照組比較：△P＜0.05

組 別 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸鹽組(10μg/mL) 3 92.1±11.7 96.2±10.7 195.0±19.0△ 210.8±16.6△ 124.2±15.0△空白對照組（2.5%FCS DMEM） 3 99.1±12.9 101.3±10.6 102.1±11.9 125.8±13.0 100.4±12.6

2.4 銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽誘導A549細胞分泌TNF-α的作用 受銅綠假單胞生物被膜藻酸鹽作用6h后，A549細胞分泌TNF-α的量開始增高，并在48 h內持續升高，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 銅綠假單胞菌作用后A549細胞上清中TNF-α濃度變化（± s） pg/mL

表4 銅綠假單胞菌作用后A549細胞上清中TNF-α濃度變化（± s） pg/mL

注：與空白對照組比較：△P＜0.05

組 別 n/孔 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h藻酸鹽組(10μg/mL) 3 29.5±3.9 67.5±5.9△ 100.1±7.6△ 155.3±13.6△ 233.2±13.5△空白對照組（2.5%FCS DMEM） 3 28.4±4.1 27.8±3.8 29.9±3.5 30.9±3.9 29.3±3.7

3 討論

一些病原微生物感染?？梢鸱卫w維化，感染引起的肺纖維化往往是肺部反復感染的結果，或病原微生物感染作為促進因素導致其它原因引起的肺纖維化迅速發展。銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）是引起醫院感染的常見病原菌之一，80%～90%肺囊性纖維化病人肺組織標本中檢出銅綠假單胞菌或其被膜菌[4]。迄今肺纖維化發生機制研究進展，主要體現在肺纖維化相關細胞及其細胞因子領域，甚至有人提出了肺纖維化發病的肺組織細胞與細胞因子網絡學說[5]。其主要內涵為：肺泡上皮細胞、肺間質細胞、單核-巨噬細胞是參與肺纖維化主要細胞，上述細胞均可分泌IL-1β、TNF-α、轉化生長因子（TGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）等，在肺纖維化發生和發展過程中發揮重要的作用[6-10]。

本研究參考文獻報道的方法[11-12]，體外誘導銅綠假單胞菌形成生物被膜，采用乙醇沉淀法提取細菌被膜并純化。選用人肺泡Ⅱ型上皮細胞株A549為靶細胞，分別檢測在銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽作用后上皮細胞分泌炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表達情況，探討其在感染性纖維化中作用。研究結果發現，A549細胞在銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽作用后其分泌IL-1β和TNF-α水平48 h內持續升高，但IL-6和IL-8則在作用后24 h達到高峰，之后有所下降。提示銅綠假單胞菌生物被膜藻酸鹽均可促A549誘生上述4種炎性細胞因子的能力增強，但其誘導分泌的TNF-α、IL-1β水平則呈現為持續性增高，而IL-6、IL-8細胞因子水平升高呈一過性。本研究結果提示肺部反復感染銅綠假單胞菌形成生物被膜，可能首先作用于肺泡上皮細胞，靶細胞啟動相關信號傳導通路，上調IL-1β、IL-6、IL-8 、TNF-α等炎性細胞因子表達，促進肺泡炎癥，進而誘導肺組織中成纖維細胞活化、增殖及轉化，從而促進肺纖維化形成。

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