6種固定液短時間固定對冰凍切片制片效果影響

徐云生 倪開志

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度，然后進行切片的方法。由于其制作過程較石蠟切片快捷、簡便，而多應用于手術中的快速病理診斷。但在冰凍切片制作過程中，影響制片的質量因素較多，從而影響手術中的快速病理診斷。因此，快速制作一張高質量的冰凍切片對于確保病理診斷極其重要。其中固定是冰凍切片制作中關鍵步驟之一，對切片的制片質量有著重要的影響。本文通過6種不同固定液短時固定對冰凍切片制片染色的比較，探討不同固定液對冰凍切片制片效果的影響。

1 資料與方法

1.1 材料 選自楚雄州人民醫院病理科手術切除的新鮮組織標本40例，包括有乳腺、甲狀腺、胃、子宮、卵巢等組織。

1.2 固定液 6種固定液分別為：10%福爾馬林;95%酒精;AF固定液;丙酮∶甲醇∶乙醚酒精(乙醚∶酒精1∶1)。

1.3 方法

1.3.1 取材及切片 取材大小為1.5 cm×1.5 cm，厚2～3 mm的新鮮組織，用OCT包埋劑包埋后，放進徠卡恒溫冷凍切片機(溫度-18℃ ～20℃)，1～2 min后，每例標本連續切片各6張，厚度4～5 μm。

1.3.2 固定及染色 切片后立即放進上述6種不同的固定液(室溫20～25℃)固定6 s。將固定過的切片用蒸餾水洗30 s，放進改良的GILL蘇木素液(預先放在65°恒溫水域箱加熱)2 min，自來水洗，1%鹽酸酒精分化液分化10 s，溫水(50℃)藍化30 s，伊紅染色30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結果

切片制作好后，通過對6種不同固定液的對比，在顯微鏡下觀察切片的組織清晰度、細胞收縮度、細胞核染色、細胞漿染色、核漿對比情況。結果見表1。

表1 6種不同固定液的對比

從觀察結果顯示，在6中固定液固定的冰凍切片中，經乙醚酒精固定后的冰凍切片，鏡下組織細胞形態清晰，細胞無收縮，細胞核、細胞漿染色鮮艷，核漿對比良好。甲醇固定的冰凍切片質量次之。95%酒精固定的切片，除細胞明顯收縮外，組織結構較清晰，細胞染色尚可。丙酮和AF液固定的冰凍切片，組織結構較清晰度稍差，細胞漿染色及核漿對比均差，而且丙酮固定的細胞收縮較為嚴重。10%福爾馬林固定的冰凍切片組織清晰度、細胞核染色、細胞漿染色及核漿比均差，同時細胞腫脹，尤其是細胞核明顯腫脹、模糊。

3 討論

冰凍切片的目的是在短時間內作出準確的病理診斷，協助臨床醫生確定病變的范圍，決定手術的范圍，因此，必須盡一切可能爭取時間，爭取盡快早出切片，并保證質量，所以快速制作一張高質量的冰凍切片非常重要。中華醫學會規定完成冰凍HE染色切片制備時間通常為20～25 min［1］，在冰凍切片制片中，固定液的選擇及固定的時間長短是冰凍切片HE染色的一個關鍵步驟。用于冰凍組織的固定液種類較多，大多數固定液需要固定幾分鐘至十幾分鐘時間，如果只固定數秒鐘，則大多數切片固達不到診斷的要求。由于冰凍切片是由快速切片，快速固定，快速染色這三個方面相互影響所造成的，其中由于組織固定液因素影響組織細胞形態的改變，對病理醫生的診斷影響最大，遠比其他技術員操作因素引起的組織細胞形態改變更難把握。研究表明10%福爾馬林雖然對組織的穿透力強，固定效果好，但需要固定的時間長，而且它不能抵消因冷凍所引起的細胞內液體的腫脹，所以甲醛固定的組織，核發生腫脹、模糊［2］。從上述6種固定液的比較來看，如果只進行數秒鐘的短時固定，10%的福爾馬林和AF液固定的組織，組織清晰度差，細胞核和細胞漿著色較淡，核漿對比差。95%酒精固定效果尚可，但細胞收縮明顯，核漿著色稍差。丙酮固定劑，對組織穿透性強，但細胞嚴重收縮，核漿對比差。甲醇固定的組織，細胞輕度收縮性，組織結構清晰，核著色好。但是乙醚酒精固定液的冰凍切片能較好的保存細胞的正常結構，組織清晰，背景干凈，細胞無收縮，核漿染色鮮艷，核漿對比良好，是6種固定液中最好的。因此，乙醚酒精可以短時間內固定細胞，縮短制片時間，是一種較為理想的冰凍切片快速固定液。

［1］中華醫學會.臨床技術操作規范，病理學分冊．北京：人民軍醫出版社，2004：10-11．

［2］孫和國，何毅敏．三種固定液對冰凍組織切片固定效果的比較．診斷病理學雜志，2001，8(2)：114．