福建地區漢族人群骨保護素基因rs2073617T/C多態性與急性冠脈綜合征病變程度的關系

羅助榮，林 毅，張克己，鄭磊磊，徐高陽

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

自發現骨保護素(osteoprotegerin，OPG)在骨代謝調節中的重要功能以來，因其在血管性疾病和動脈粥樣硬化中發揮的重要作用引起了人們的廣泛關注［1］。但有關OPG基因多態性與急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的關系，國內鮮見文獻報道。本研究旨在分析OPG基因啟動子rs2073617T/C位點基因在福建漢族人群中的分布情況，以初步了解其多態性與ACS的發病及病變程度是否存在相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 ACS組360例均符合ACS診斷標準［2-3］，其中男 216例，女144 例；對照組 120 例，男62例，女58例，均為福建地區無血緣關系漢族人。排除標準：合并有急慢性感染、惡性腫瘤、風濕性心臟病、瓣膜鈣化、嚴重肝腎功能異常、重度心功能衰竭、甲狀腺或腎上腺功能紊亂、鈣代謝異常及免疫系統疾病等均予排除。

1.2 方法

1.2.1 冠狀動脈造影 采用Judkins法按常規操作。根據1984年美國心臟協會規定的冠脈血管圖像分段評價標準：冠脈造影顯示任何1、2、3枝主要冠狀動脈一段狹窄＞50%為單枝、雙枝、三枝病變，左主干病變計為2枝病變。根據Gensini積分系統對各枝血管狹窄程度進行定量分析：無異常發現為0分、狹窄＜25%為1分、26% ～50%為2分、51%～75%為4分、76% ～90%為8分、91% ～99%為16分、100%為32分，患者冠狀動脈病變程度的最終積分為各分枝積分之和。

1.2.2 生化指標測定 清晨空腹采肘靜脈血5 ml，3000 r/min(離心半徑8 cm)，離心10 min取血清，采用Olympus Au2700全自動生化分析儀檢測。

1.2.3 靜脈血基因組DNA提取 所有受試者禁食12 h后清晨空腹采血，EDTA抗凝，采用美國OMEGA公司全血DNA分離提純試劑盒提取基因組DNA，-20℃保存。

1.2.4 PCR擴增 應用多聚合酶鏈式反應(PCR)擴增OPG基因啟動子rs2073617T/C多態性片段。PCR引物采用Primer Premier 5.0軟件設計，由上海生工公司合成。OPG rs2073617T/C上游引物序列：5’-GAAGTGAAGGGGTCAGGCAGC-3，下游引物序列：5’-GTCTGTCTCTCTCTTGCTGTCTTCC-3，擴增反應體系 20μl，其中含滅菌雙氧水 12.8μl，10 × PCR反應緩沖液 2μl，dNTPs 0.4μl，上游引物(10μM)0.4μl，下游引物(10 μM)0.4μl，DNA 模板 2μl，Taq酶2 U，覆蓋石蠟油。反應條件為：95℃預變性3 min；95℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，循環 35 次；72℃ 5 min；2%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照。

1.2.5 擴增產物的限制性酶切和DNA測序檢測 OPG rs2073617T/C PCR產物分別用HincII限制性酶(TaKaRa公司)于37℃水浴消化16 h，并經電泳證實。同時PCR產物利用ABI370型DNA測序儀(ABI公司，USA)進行測序鑒定。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件。計算各基因型及等位基因頻率，兩組間基因型分布做Hardy-Wrinberg平衡分析，以確定研究樣本的群體代表性。計量資料以表示。組間計量資料比較采用方差分析或t檢驗，各組之間基因型和等位基因頻率分布采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 兩組年齡、性別、體重指數、高血壓、三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)的差異均無統計學意義(P＞0.05)，ACS組吸煙、糖尿病、HDL-C顯著高于對照組(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 研究對象的Hardy-Weinberg平衡檢驗 OPG基因rs2073617T/C多態性基因型分布在兩組中的觀察值與理論值相吻合，表明研究對象符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。

2.3 OPG rs2073617T/C基因多態性 經HincII限制性酶酶切后可見三種基因型：855 bp處出現單個條帶為TT純合子，雜合子TC產生855 bp、460 bp和395 bp三條帶；純合子CC產生395 bp，460 bp二條帶。DNA測序鑒定的結果亦證實上述rs2073617T/C位點3種基因型的存在。電泳圖和測序圖見圖1、圖2。

圖1 OPG基因rs2073617T/C酶切電泳及測序結果

圖2 OPG基因rs2073617T/C測序結果

2.4 OPG基因rs2073617T/C多態性分布與比較與對照組比較，ACS組OPG基因rs2073617T/C多態位點的基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義(P均＞0.05)，見表2。

表2 基因型及等位基因頻率在兩組間的分布［例(%)］

2.5 OPG rs2073617T/C位點多態性與ACS病變程度的關系 ACS患者根據冠脈造影結果分為單枝、雙枝、三枝病變組。其中單枝病變組166例、雙枝病變組100例和三枝病變組94例，對照組120例。OPG rs2073617T/C各基因型在四組之間比較的差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。ACS患者三種基因型與冠狀動脈Gensini評分間的差異亦無統計學意義(P＞0.05)，見表4。

表3 OPG rs2073617T/C位點多態性與ACS病變枝數的關系［例(%)］

表4 OPG rs2073617T/C基因多態性與冠脈病變枝數Gensini評分的關系

3 討論

OPG于1997年在美國和日本兩家實驗室同時被發現［4-5］，它是一種分泌型糖蛋白，其前體含有401個氨基酸的殘基，N-末端的21個氨基酸為信號肽序列，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，其mRNA在多種組織廣泛表達，如心臟、肺、甲狀腺、腎臟和骨等。它與細胞核因子kB受體活化因子配體(RANKL)，核因子kB受體活化因子(RANK)組成OPG/RANKI/RANK系統。OPG系統與骨代謝，心血管系統及免疫系統疾病等都有著密切的關聯。

Palazzuoli等［6］發現OPG水平在穩定性冠心病中明顯增高，但低于ST段抬高的心肌梗死患者。不穩定心絞痛和非ST段抬高的心肌梗死OPG水平升高但無顯著差異。Omland等［7］研究發現，與傳統的危險因素相比，OPG可以更好的預測急性冠脈綜合征患者遠期死亡率和心力衰竭的發生。以上研究表明，OPG不僅能夠參與骨代謝，而且參與動脈粥樣硬化的進展，并與ACS的發病及預后密切相關。因此，探討OPG基因多態性與ACS間的相關性具有重要意義。

人類OPG基因是單拷貝基因序列，全長29 kb，位于染色體8q23-24上具有5個外顯子。國外一些學者［8］初步發現 OPG 950以及1181位點，其多態性與血管中層鈣化密切相關。我們研究發現在福建地區漢族人群中，OPG基因rs2073617T/C多態性存在TC、TT、CC三種基因型，其在ACS組和對照組中的頻率分別為 43.3%、33.3%和 23.3%，以及47.7%、26.7%和25.6%，兩組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)；Ohmori等［9］對日本男性冠心病患者血清OPG進行研究，結果顯示OPG基因型950C/C與ACS顯著相關，并且與血清OPG水平的升高有關。本研究根據造影結果將ACS患者分為單枝、雙枝、多枝病變組，并分析其與OPG基因多態性的關系，結果發現OPG基因rs2073617T/C基因型及等位基因頻率與冠狀動脈病變枝數間差異無統計學意義(P均＞0.05)；對ACS患者病變程度Gensini評分，分析其與三種基因型間的關系顯示差異亦無統計學意義(P＞0.05)。Soufi等［10］研究發現 OPG不同位點的基因型與冠心病相關性差異較大，應用多聚合酶鏈式反應-梯度凝膠電泳判別OPG基因發現存在多個突變位點：149 T/C、163 A/G、209 G/A、245 T/G、950 T/C(以上位點都在啟動子區域)、1181 G/C(位于第l外顯子)6890 A/C(位于第4內含子)。單個位點基因多態性與冠心病發生雖無獨立相關性，但950 T/C和1181 G/C位點的聯合多態性分析顯示攜帶950 TC/1181 GC或950 CC/1181 CC基因型的患者具有冠心病發病的高危因素。

本研究發現OPG基因rs2073617T/C多態性與福建地區漢族人群中ACS的發生及冠狀動脈病變程度無相關性。但并不能說明OPG基因多態性與ACS沒有關系，因為本研究僅選取了OPG基因的一個多態性位點，即OPG 950位點，很明顯探討OPG基因多個位點及連鎖多態性與ACS的相關性將更具有意義。

［1］羅助榮.骨保護素系統與動脈粥樣硬化的研究進展［J］.東南國防醫藥，2010，12(6)：523-525.

［2］中華醫學會心血管病學分會.不穩定型心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南［J］.中華心血管病雜志，2007，35(4)：295-304.

［3］Antman EM，Armstrong PW，Bates ER，et al.2007 Focused Update of the ACC/AHA 2004 Guidelines for the Management of Patients With ST-Elevation Myocardial Infarction［J］.JACC，2008，51(2)：210-247.

［4］Sirnonet WS，Laeey DL，Dunstan CR，et al.Osteoprotegerin：a novel seelated protein involved in the regulation of bone density［J］.Cell，1997，89(2)：309-319.

［5］Tsuda E，Goto M，lVlochizuki S，et al.Isolation of a novel cytokinefrom hurmn fibroblasts that specifically inhibits osteoclastogenesis［J］.Bioehem Biophys Res Contain，1997，234(1)：137-142.

［6］Palazzuoli A，Ascione R，GallottaM，et al.Osteoprotegerin and B-type natriuretic peptide in acute coronary syndromes with preserved systolic function：relationto coronary artery disease extension［J］.Int J Cardiol，2009，137(3)：295-298.

［7］Omland T，Ueland T，Jansson AM，et al.Circulating osteoprotegerin levels and long-term prognosis in patients with acute coronary syndromes［J］.J Am Coll Cardiol，2008，51(3)：627-633.

［8］Hofbauer LC，Schoppet M.Osteoprotegerin gene polymorphism and the risk of osteoporosis and vascular disease［J］.JACC，2002，87(9)：4078-4079.

［9］Ohmori R，Momiyama Y，Taniguehi H，et al.Association between osteoprotegerin gene polymorphism and coronary artery disease in Japanese men［J］.Atherosclerosis，2006，187(1)：215-217.

［10］Soufi M，Schoppet M，Sattler AM，et al.Osteoprotegerin gene polymorphisms in men with coronary artery disease［J］.Clin Endocrinol Metab，2004，89(8)：3764-3768.