高糖中膀胱ICCs超微結構的變化

范勇洪

作為膀胱舒縮活動的起搏和傳導者，ICCs細胞在膀胱活動中起著關鍵作用［1］。其功能改變可能是造成膀胱功能障礙的原因。因此推測，DCP發病可能與ICCs改變有關。本研究通過單細胞培養、觀察ICCs超微結構在高糖環境中的變化，探討DCP功能改變的細胞生物學基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料 英國種健康豚鼠，透射電鏡。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠膀胱ICCs細胞的體外培養和制備 脫臼處死豚鼠，無菌手術取出其膀胱，取肌層并剪成碎塊，膠原酶V消化，制成無糖的DMEM細胞懸液于培養皿中，培養箱中培養24 h，棄去原液，分別加入5、10、15 mmol/L葡萄糖 DMEM 細胞培養液，繼續培養24、72 h。胰蛋白酶消化，刮刀刮取ICCs細胞，高速離心，戊二醛固定細胞團。

1.2.2 電鏡觀察 細胞團經沖洗、固定、梯度序列丙酮浸泡脫水、聚合后，超薄切片，再醋酸鈾、檸檬酸鉛順序染色后，切片置于透射電鏡下，選圖像清晰之ICCs細胞觀察。

2 結果

ICCs細胞超微結構在高濃度糖環境中發生明顯變化，隨培養液中糖濃度升高及時間增長，ICCs細胞損害也就越明顯。①5 mol組培養24和72 h組后，ICCs細胞無明顯變化，鏡下見核仁大而多，核漿比例大，線粒體豐富，胞突長而少。②10 mol組培養24 h則見核仁多，邊集，核漿比例大，細胞內部細胞器減少，比如核糖體、內質網數量減少，內質網開始擴張，胞突變短，細胞內較多顆粒狀類釋放物存在，多位于胞突內，顆粒狀物外有被膜。培養72 h后可見核仁大，數量多且形態不規則，核漿比例增大，細胞內部細胞器更少，細胞內顆粒狀類釋放物更多，位于胞突，并且有向外釋放之勢，胞突特別多且更短。③15 mol組培養24 h后可見細胞分散，不成片，細胞體積增大，其內顆粒狀類釋放物較多，也存在于胞突，細胞器也明顯減少，胞突幾近于消失。培養72 h后可見細胞不成片，細胞體積增大，核大，其內異染色質明顯減少，胞漿內粗面內質網、線粒體數目極少，線粒體明顯大小不一，游離核糖體增加，部分細胞膜局部呈現壞死灶，胞突完全消失。

3 討論

眾多科研成果提示ICCs細胞在膀胱活動的起搏器、傳導器。膀胱不依賴神經以及體液因素可以自發的興奮、收縮［2］，ICCs細胞可測到自發的電位變化［3］，尿路全程均有ICCs存在［4-6］。糖尿病最常見癥狀之一是DCP，其病變原因不明確。因此我們推測，ICCs細胞功能變化可能與DCP發病有關。可能是高糖破壞ICCs超微結構引起DCP的事發病。

本次研究用單種細胞體外培養，來觀察高葡萄糖濃度下膀胱ICCs內部超微結構的變化。發現糖濃度升高及培養時間長，ICCs細胞內結構破壞就越明顯。

圖片對比可見，5 mol/L糖濃度沒有影響ICCs細胞，胞內細胞器豐富，胞突少而長，即生理范圍內的糖濃度不影響ICCs。10 mol/L經培養24和72 h后均明顯出現細胞結構的破壞，核仁多，邊集，核漿比例大，細胞內部細胞器比如核糖體、內質網數量減少，內質網開始擴張，胞突變短，細胞內較多顆粒狀類釋放物存在，多位于胞突內，顆粒狀物外有被膜。而培養72 h后細胞結構破壞更明顯，核仁大而多，且形態不規則，細胞內部細胞器更少，而顆粒狀類釋放物更多，并且有向外釋放之勢，胞突多且更短，呈絨毛狀。推測高濃度糖刺激下，破壞ICCs內部超微結構，刺激ICCs細胞代償性生理功能增強，造成其分泌顆粒如神經遞質等增加。15 mol/L組細胞破壞更甚于10 mol組.培養24 h后細胞分散，不成片，細胞體積增大，顆粒狀類釋放物較多，細胞器也明顯減少，胞突幾近于消失。培養72 h后，細胞不成片，核內異染色質明顯減少，粗面內質網、線粒體數目極少，線粒體明顯大小不一，游離核糖體增加，部分細胞膜局部呈現壞死灶，胞突完全消失。過高的葡萄糖濃度刺激，短時間內可造成ICCs細胞代償性功能增加，但培養時間增長，過高的葡萄糖濃度持續的破壞，使細胞能量來源的結構基礎線粒體被破壞，粗面內質網上的核糖體脫落，造成ICCs細胞生理功能喪失或下降。

研究結果顯示，ICCs功能及其結構的變化與高濃度糖的內環境有密切關系。內環境中糖濃度的升高、作用的時間長，則ICCs細胞結構及功能變化也就更明顯。由此推測：高濃度糖破壞ICCs細胞的超微結構、胞突消失，造成該類細胞的起搏和傳遞中介的功能、結構變化，導致膀胱興奮能力變化，膀胱逼尿肌舒縮能力產生變化，而使DCP臨床癥狀出現。高糖中ICCs細胞的超微結構被破壞有可能是臨床發生DCP的病理基礎之一。

［1］Jiang HH，SongB，Lu GS，et al.Loss of ryanodine receptor calcium release channel expression associated with overactive urinary bladder smooth muscle contractions in adetrusor instability model．BJU Int，2005，96(3)：428-433．

［2］Andersson KE，Arner A.Urinary bladder contraction and relaxation;physiology and pathophysiology. Physiol Rev，2004，84：935-986．

［3］McCloskey KD.Characterization of outward currents in interstitial cells from the guinea pig bladder．J Urol，2005，173：(1)：296-301．

［4］Davidson R A，McCloskey KD.Morphology and localization of interstitial cells in the guinea pig bladder：structural relationships with smooth muscle and neurons．J Urol，2005，173(4)：1385-1390．

［5］McCloskey KD，Gurney AM.Kit positive cells in the guinea pig bladder．J Urol，2002，168(2)：832-836．

［6］Exintaris B，Klemm MF，Lang RJ.Spontaneous slow wave and ontractile activity of the guinea pig prostate．，J Urol，2002，168(1)：315-322．