肺癌干細胞在肺癌診斷和治療中的研究進展

曾 梁 王共先

腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）原理認為腫瘤是由少數能促發癌變的腫瘤干細胞和占絕大多數的普通腫瘤細胞組成的，腫瘤干細胞對化療耐藥，是導致腫瘤復發和轉移的主要原因[1]。因此，研究腫瘤干細胞對于明確腫瘤發生、發展的機制有重要意義，從而為腫瘤的治療帶來新的曙光。肺癌是全球導致死亡最常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害人類生存健康。盡管現在治療水平已有很大進步，但肺癌患者的生存率只有15%左右，迫切要求有新的、富有成效的治療策略去提高療效。肺癌干細胞的發現及對其生物學特性的研究，為肺癌的臨床治療提供了新靶點,目前已逐漸成為肺癌防治研究的新的熱點。本文就肺癌干細胞的研究進展做一綜述。

1 腫瘤干細胞

腫瘤干細胞的存在是引起腫瘤發生的始動因素，其支持證據在于，腫瘤干細胞具有干細胞性質，它具有無限的自我更新能力，可以產生與上一代完全相同的子代細胞，并且具有多種分化潛能和高度增殖能力,產生不同表型的腫瘤細胞,盡管腫瘤干細胞在腫瘤組織中僅少部分存在，但是它的這些特征使得腫瘤在體內不斷擴大，或形成新的腫瘤。

最早證實腫瘤干細胞引發腫瘤的是急性粒細胞性白血病[2]。Bonnet等[3]證實在急性粒細胞白血病所有細胞中，僅表面標志為CD34+和CD38-的癌細胞能夠在NOD/SCID小鼠體內形成急性粒細胞白血病，這部分細胞所占比例僅為細胞總數的0.2%。進一步研究發現，它們與正常造血干細胞有許多相似之處，能夠在小鼠體內連續傳代，所形成的移植瘤灶與原腫瘤具有相同的形態學特征，而其他絕大部分細胞均不能形成移植瘤灶[4]。盡管存在一些技術上的限制，但越來越多的研究證實在實體瘤中存在腫瘤干細胞。人們正在嘗試在多種惡性腫瘤中通過特異性的生物標記去檢測和分離腫瘤干細胞，包括肺癌[4-5]。

隨著表面標記的不斷發現，人們逐漸意識到這些標記對于識別腫瘤干細胞并不是很理想。例如CD133+表面標記，最初認為其是惡性膠質瘤和成神經管細胞瘤的腫瘤干細胞的可靠標記[6]。但已有實驗證實,惡性膠質瘤中的CD133-細胞同樣可以像CD133+細胞一樣形成腫瘤[7]。并且在正常的神經祖細胞中CD133+也高度表達[8]。另外，正如腫瘤的不均一性一樣，即便是同一類腫瘤，腫瘤干細胞的表型也是不一致的。例如結腸直腸癌，其腫瘤干細胞主要是CD133+亞細胞群[9-10]，但有研究報道結腸直腸癌干細胞存在EpCAMhi、CD44hi亞細胞群[11]。最新的研究指出結腸直腸癌干細胞主要是ALDH-標記,以ALDH-作為腫瘤干細胞的初步篩選標記，再結合CD133+和CD44+標記進行進一步篩選，從而可以較為準確地分離結腸直腸癌干細胞[12]。腫瘤干細胞標記的多樣性，要求研究者在分離腫瘤干細胞時，尋求更多的特異性的標記或者采用標記結合的方式進行分離，以提高準確率。

2 肺癌

肺癌是嚴重危害人類生存健康的惡性腫瘤之一，其5年存活率很低[13]。現在已經公認吸煙是引發肺癌的主要病因，其他造成肺癌發生的危險因素包括吸入石棉，接觸氡、砷、鉻、鎳，另外其也可由一些肺部的良性疾病轉變而來[14]。不同的病因可以導致多種類型的肺癌，并且其診斷、預后和治療策略會有所不同。為了便于治療和估計預后，肺癌可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，非小細胞肺癌從組織學上又細分為腺癌、鱗狀上皮細胞癌和大細胞癌[15]。小細胞癌占肺癌的20%，盡管發病初期對化療比較敏感，但預后均很差。研究認為分化的神經內分泌細胞可能是小細胞肺癌的主要來源[14]。腺癌是最常見的非小細胞癌，它的起病部位多是終末細支氣管和肺泡的連接處，因此腺癌的主要來源是氣道、肺泡或兩者兼而有之[16]。鱗狀上皮細胞癌的發病率大約為25%，且與吸煙密切相關，它的發病部位主要在二、三級支氣管，很少在遠端的細支氣管發病。與其他類型的非小細胞癌相比，大細胞癌分化程度較高，惡性程度較小，最常見的類型是大細胞神經內分泌癌。

肺癌發生的遺傳變化分析顯示肺癌組織病理方面的差異與這種疾病的遺傳異質性有關，并且，在3大類非小細胞肺癌中已經發現了遺傳方面的差異。蛋白表達方面的研究進一步證實，不僅小細胞肺癌和非小細胞肺癌之間存在差異，而且非小細胞肺癌的3個亞型之間也存在明顯差異[17]。然而，臨床上對于非小細胞肺癌，不論其生物學上的差異，均采用同一方案進行治療，這可能是肺癌治療效果不好的一個主要原因[18]。目前，臨床醫生在治療中試圖對每一類型的肺癌分別制定化療方案，以獲得最佳治療效果[19]。除了組織學方面的差異外，人們現在正努力尋找與各類肺癌臨床表現有關的生物學特點。在腺癌中,KRAS基因突變常發生于吸煙導致的肺癌患者,并且預示對化療耐藥，預后較差。不是吸煙導致的肺癌患者，主要是出現表皮生長因子受體的突變，預后較好。從臨床治療的角度來看，表皮生長因子受體突變的患者對表皮生長因子受體阻斷劑有較好的敏感性，而KRAS突變的患者則對此阻斷劑耐藥[20]。因此，從表皮生長因子受體和KRAS這2種不同突變方式，可以將非小細胞肺癌的患者區分為兩類，這兩類從發病史、治療方案方面均有所不同。腫瘤干細胞不僅在尋找抗癌藥物方面，而且在診斷、評判治療效果方面發揮重要的作用。然而，腫瘤干細胞在腫瘤組織中所占的比例很小，這為研究帶來困難。

3 人肺癌干細胞

肺癌干細胞的識別一直是存在爭議的。Kim等[21]首先在成鼠肺支氣管肺泡交叉處發現了一群表面物異性表達Sca-1+CD45-Pecam-CD34+的標志蛋白,具有干細胞特有的自我更新和多功能分化的能力。支氣管肺泡干細胞被發現以來,人們對肺癌干細胞的認識在動物模型上達到了一個突破性的階段。研究者們可以用不同的方式從細胞系和原發性腫瘤中分離出成瘤的人肺癌細胞。最早發現的分離方法是基于干細胞表達SP表型的原理[22]。從H46O、H23、HTB-58、A549、H441和H2170細胞系中分離出的具有SP表型的肺癌細胞與無SP表型的肺癌細胞相比，具有更強的侵襲性，對化療藥物更加耐藥，并且在體內實驗中有明顯的致瘤性。第2種分離方法是基于人們普遍認為的腫瘤干細胞耐藥的原理[23]。所以通過順鉑、阿霉素、鬼臼霉素的篩選，得到的細胞具有如下的腫瘤干細胞特點：高度的克隆能力，富含SP表型，表達胚胎干細胞標記，自我更新和分化能力，高度的致瘤性。第3種分離方法是基于在干細胞群中ALDH活性明顯升高的原理[24]。從肺癌細胞系分離出的ALDH陽性的細胞，不論是體內實驗，還是體外實驗，都具有明顯的腫瘤干細胞的特征。

在Eramo等[25]的實驗中，人肺癌干細胞被分離基于其可以在無血清培養基中存活并像細胞簇一樣增殖的原理。這個實驗是迄今為止最好的從原發性肺癌患者獲得無限擴增的腫瘤干細胞的方法，為深入研究肺癌干細胞提供了強有力的武器。因為肺癌干細胞在原發性腫瘤中所占比例很小，如果它們不能在體外進行擴增的話，幾乎就不可能進行深入地研究。運用Eramo等[25]的方法，研究者可以得出足夠數量的肺癌干細胞,并對其特征進行深入研究。以此方法得到的肺癌幾個亞型（小細胞肺癌、腺癌、鱗狀上皮細胞癌和大細胞癌）的細胞簇均具有干細胞的特征，這些肺癌細胞簇對大部分治療肺癌的傳統藥物均耐藥。并且，它們表達胚胎基因，如nanog和OCT-4，這進一步證實了這些肺癌細胞簇的未分化特征。

4 肺癌干細胞在診斷、預后及評價治療效果方面的意義

腫瘤干細胞方面的深入研究，為肺癌的診斷、預后及評價治療效果帶來了巨大的進步。現在的觀點普遍認為腫瘤干細胞較其他的腫瘤細胞有更強的侵襲性，腫瘤的惡性程度與細胞的分化等級、腫瘤干細胞所占的比例有密切關系。分離、擴增腫瘤干細胞技術的飛速發展，使得人們可以在患者體內識別腫瘤干細胞相關抗原及進行免疫檢測。估算腫瘤干細胞在腫瘤中所占的比例，可以作為一種診斷手段更準確地判斷腫瘤的分期。近來的研究已開始注重采用肺癌干細胞技術加強對肺癌的診斷。已有研究報道，表達腫瘤干細胞相關標記ALDH1和Sox2多與較高等級的肺癌有關[24]。同時，其他的腫瘤干細胞標志物、胚胎基因的檢測對提高診斷肺癌分期的準確性有很大幫助。這種更為準確的診斷對于加強肺癌的治療、監測治療結果有重要意義，因為治療方案的選擇與腫瘤的分型、分期密切相關。

“循環的腫瘤細胞”對于評價腫瘤的預后有十分重要的意義[26]。“循環的腫瘤細胞”是指那些在患者血液當中發現的癌細胞，會導致腫瘤的轉移。現在的影像學技術無法發現早期轉移的腫瘤。因此，發展了許多檢測早期轉移腫瘤的方法，這些方法無外乎是通過免疫學、流式、分子生物學等方法對循環的腫瘤細胞進行檢測。腫瘤細胞有可能會流動，但僅僅只有一小部分腫瘤細胞會經血管遷移，種植于其他的組織，生成腫瘤，從而形成腫瘤的轉移。正如在乳腺癌中的發現，這些“循環的腫瘤細胞”具有腫瘤干細胞的特點[27]。因此，這些流動的腫瘤干細胞可以作為判斷預后的工具，從而預測腫瘤的進展。

與患者預后有關的腫瘤干細胞相關因素的研究，也可以預測患者對治療的反應，這對于選擇優化的治療方案十分重要。研究已證實，在不同腫瘤中腫瘤干細胞抗原的表達與腫瘤的預后密切相關[28]。在早期肺部腫瘤中，ALDH1表達越高，則患者的預后就越差[24]。在治療初期，用幾個腫瘤干細胞的生物指標檢測治療方案的效果，以一種治療方案去替代無效、高毒的治療方案。在治療末期，也需要檢測特定的生物標記，從而監視腫瘤的進展、復發。當前監測治療效果的生物標記主要是在患者血液中腫瘤細胞的豐度，或是血漿中腫瘤蛋白的水平。因為腫瘤的復發主要與腫瘤干細胞的存在有關，所以對于治療效果的監測應加強對腫瘤干細胞相關生物標記的檢測。用傳統的抗腫瘤藥物進行治療，可能導致腫瘤的縮小，以現在普遍的治療觀點來看，是一個治療效果較好的表現。然而，由于藥物可能優先殺死那些已分化的細胞，盡管瘤體縮小，但是末分化的腫瘤干細胞所占的比例明顯增加。所以腫瘤干細胞相關的生物標記的檢測對于腫瘤的預后和抗腫瘤效果的監測更為重要。

盡管隨著射靶療法的發展，臨床醫生們對于改善肺癌患者的預后仍是毫無進展。因此，針對肺癌成瘤的主要病因-肺癌干細胞的研究尤為重要，可以認為，真正對肺癌有效的創新性的藥物必然是肺癌干細胞所敏感的藥物。當肺癌干細胞的研究進一步深入，人們從肺癌中分離腫瘤干細胞已不存在問題時，肺癌的臨床治療將邁上一個新的臺階。

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