心肌Cx43在缺血預處理抗心律失常中的作用

陳向來，唐燕華，楊崛圣

（南昌大學第二附屬醫院胸外科，南昌330006）

缺血預處理（ischemic preconditioning，IP）是細胞自我保護機制的啟動過程，1986年C.E.Murry等［1］提出缺血預處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷、減少心律失常，但其機理仍未完全闡明。臨床上多數心臟病人在術前已有不同程度的心肌肥厚等病變，在經歷體外循環直視手術的急性缺血后比正常心肌更容易出現各種心律失常。本實驗通過結扎肥厚心肌兔冠狀動脈復制心肌急性缺血模型，對其中部分進行缺血預處理，觀察其對缺血心肌的保護作用，并從縫隙連接蛋白（Cx43）角度進一步探討心律失常的發生機制及IP對減少心律失常的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1）動物：新西蘭大耳白兔14只，體質量2.2～2.5kg，由南昌大學實驗動物中心提供。2）試劑：蘇木素伊紅液（南昌大學病理教研室提供），抗Cx43多克隆抗體（博士德公司），SABC（熒光CY3）試劑盒（博士德公司，內容：正常山羊血清5mL，生物素化二抗0.5mL，S ABC－cy3 0.5mL），PBS磷酸緩沖液，純丙酮、二甲苯、緩沖甘油、無水酒精、中性樹膠。3）設備及器材：H2S－D恒溫水溶箱（哈爾濱儀器儀表公司），BL－410生物機能實驗系統（成都泰盟），實驗動物呼吸機（浙江大學醫學儀器廠），石蠟及冰凍切片機（英國珊頓），激光掃描共聚焦顯微鏡（包括熒光顯微鏡彩色成像輸入儀和Image－Analysis圖像分析系統）。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備

參照A.F.Cutilleta等［2］的方法建立兔左心室肥厚模型，6周后將左心室肥厚的兔參照汪謙［3］的方法建立兔肥厚心肌急性缺血模型。

1.2.2 實驗分組

14只新西蘭大耳白兔均制模成功，將其按隨機數字表法分為2組，每組7只。1）缺血再灌組（IR組）：閉塞冠狀A前降支30min，再灌90min。2）缺血預處理組（IP組）：在缺血前預先缺血5min，再灌5min。

1.2.3 心電圖指標的觀察和測定

以改良Curtis and Ravingerova評分方法進行評分。1）1分：ST段抬高或QRS波增寬；2）2分：偶發室性早博 （vencreular extrasystole，VE）；3）3分：成對VE、VE二聯律三聯律或VE≥5次；4）4分：頻發VE（1min內VE≥5次）；5）5分：室性心動過速（ventricalar tachycanelias，VT）一陣＜30s；6）6分：VT一連≥30s；7）7分：室顫（vertrianler－fibrielation，VF）多陣累計＞30s；8）8分：VF一連＜5min；9）9分：VF多陣累計＜5min或一陣≥5min；10）10分：VF多陣累計＞5min。

1.2.4 心肌標本的取材與保存

實驗操作結束后，立即取動物心臟，濾低吸干血跡，取左冠狀動脈前降支發處約0.6cm處取前降支支配區整層心肌一塊放入液氮中保存，備冰凍切片，行免疫組化。

1.2.5 Cx43免疫組化

1）所有玻片均行防脫片處理。2）冰凍切片，片厚4μm。取一組冰凍切片，爾后將玻片放入純丙酮，室溫固定20～30min。3）固定完成后放入PBS中，3min×3次。4）洗完后，每張切片標本用免疫組化筆畫圈以節省抗體。5）每個標本滴加20μL 10%山羊血清，以消除非特異性抗原。6）10min后不洗，滴加1∶100單抗20μL，PBS稀釋后放入濕盒，4℃過液16～18h。7）過液后，PBS 5min×3次。8）棄去PBS液，標本滴加1∶60生物素化二抗20μL。放入37℃電熱恒溫水浴箱30min。9）取出標本，PBS 5min×3次。10）棄去PBS液，每個標本加1∶120熒光素Cy3 20μL，放入37℃電熱恒溫水浴箱30min。11）取出玻片，甩去多余液體，加緩沖甘油封片，4℃保存，第2天在熒光顯微鏡下觀看。

1.2.6 圖像分析

取玻片，放在倒置熒光顯微鏡下，每張玻片各取4個視野，亮度對比度均為50，攝片。每個視野以Image－Analysis圖像系統進行圖像分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 2組心電圖情況比較

IR組有3例發生VT（VT一陣＜30s、VT一連≥30s、VF多陣累計＞30s各1例），有5例發生VE（其中2例為頻發VE，3例為偶發VE），1例未出現明顯的心律失常，但有明顯的ST段的抬高。IP組有1例發生一陣＜30sVT，之前還曾發生成對VE和頻發VE，5例發生VE（其中1例為頻發VE，4例為偶發VE），2例未出現明顯的心律失常，但有ST段的抬高和QRS波增寬。總體來說IR組發生了較多的室性心律失常，且更為嚴重，IP組VT明顯減少，VE程度減輕。用改良Curtis and Ravingerova評分方法評分，IR組評分為（4.286±1.976）分，IP組評分為（2.286±1.380）分，IP組較IR組評分顯著下降（P＜0.05）。

2.2 2組Cx43比較

IR組Cx43面積為（1 443.35±231.46）μm2，IP組Cx43面積為（1 911.72±214.77）μm2，IR 組較IP組顯著減少（P＜0.05）。

2.3 Cx43與改良Curtis and Ravingerova評分的相關關系

缺血心肌包括單純缺血和經過預處理的缺血心肌，以Cx43面積作為因變量（x），改良Curtis and Ravingerova評分值作為結果（y），對二者進行直線分析回歸。結果顯示，隨著心肌Cx43面積水平的升高，Curtis and Ravingerova評分值呈下降趨勢，二者存在負相關（r＝－0.683，P＝0.007）。回歸方程為：y＝10.137－4.08×10－3x，P＝0.001。

3 討論

由心肌缺血引發的心律失常，是心外科術后常見的并發癥之一。在心外科臨床上，多數心臟病人在術前已有不同程度的心肌肥厚等病變，在經歷體外循環直視手術的急性缺血后比正常心肌更容易出現各種心律失常。肥厚心肌有不同于正常心肌的供血和心電傳導結構，其發生室性心律失常機制尚不完全清楚。資料表明，異常心電活動的發生與縫隙連接通道有關。作為哺乳動物心室工作細胞最重要的縫隙連接蛋白，Cx43是目前研究的最多的一種［4］。G.E.Morley等［5］對 Cx43缺陷鼠采用光標法測定心室的傳導性，Cx43缺陷鼠的細胞僅在低水平存在電耦聯，細胞間連接的傳導性下降了60%，僅顯示了較低水平的電耦聯。結合以往的資料，人們認為以Cx43為主組成的低阻力通道的電耦聯使心肌細胞同步收縮，并通過離子交換發揮調控作用，以此在維持正常節律的電生理中起重要作用，而縫隙連接的結構或功能的改變均可能引發心律失常。

關于IP抗心律失常的機制目前存在2種觀點。一種觀點認為IP本身不具有直接抗心律失常的作用，它是通過縮小梗死面積和延緩心肌細胞壞死時間從而延緩和減輕了心律失常的發生。但隨著研究的深入，發現IP本身能引起心肌組織電生理特性的改變并由此發揮直接抗心律失常的作用［6］。本研究結果發現預處理可減輕缺血再灌注室性心律失常的發生，并減輕缺血再灌注后Cx43表達的下降。本研究對Cx43面積和改良Curtis and Ravingerova評分值進行相關分析，發現隨著Cx43面積的增加，評分值呈下降趨勢，二者存在負相關關系，提示Cx43在其中起積極作用。

許多研究已證明，蛋白激酶C（PKC）是IP的關鍵因素，其中的機理之一就是激活ATP敏感性鉀通道，（K＋ATP通道），促進 K＋外流，抑制Ca2＋內流，縮短動作電位的過程，降低心肌細胞鈣超載，從而起到保護作用。實驗證明Cx43為磷酸蛋白，由此筆者推測Cx43在IP減少心律失常中的作用有如下幾方面：1）IP激活PKC，通過PKC磷酸化修飾維持Cx43的正常耦連，保證K＋ATP通道開放，促進K＋外流，縮短了造成單向阻滯的時間窗口，起到減少折返性心律失常的作用；2）IP激活K＋ATP通道開放，促進K＋外流，導致細胞外K＋升高，而低鉀是誘發觸發激動重要原因，因此IP可能通過減輕Cx43表達的下降，減輕由于觸發激動而引起的心律失常的發生；3）IP激活K＋ATP通道開放，可使其后缺血1～5min時靜息膜電位（RMP）迅速降低，導致再灌注時RMP超極化。減輕由于自律性異常而引起的缺血及再灌注心律失常的發生。

綜合而言，IP可能通過心律失常發生的各個環節減輕它的發生，K＋ATP通道開放是IP減少心律失常發生的一個中間環節，而它正是通過Cx43的正常耦連來實現的，因此Cx43可能是IP抗心律失常的結構基礎。

［1］ Murry C E，Jennings R B，Reiner K A.Preconditioning with ischemia a delay of lethal cell in injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124－1136.

［2］ Cutilleta A F，Rudnik M，Iak R.Muscle and nonmuscle cell RNA polymerase activity during the development of myocardial hypertrophy［J］.J Mol Cell Cardiol，1978，10：677.

［3］ 汪謙.現代醫學實驗方法［M］.北京：人民衛生出版社，1997：907.

［4］ Sever N I，Dupont E，Thomas N.Alterations in cardiac connexin expression in cardiom yopathies［J］.Adv Cardiol，2006，42：228－242.

［5］ Morley G E，Vaidya D，Samie F H，et al.Characterization of conduction in the ventricles of normal and heerozyrous Cx43 knockout mice using optical mapping［J］.J Cardiovasc Eleectrophysiol，1999，10：1361－1375.

［6］ Lin I，Li Y，Lin S，et al.The effect of delayed preconditioning on connex in 43in ischemic myocardium［J］.Biochem Cell Biol，2007，85（2）：175－181.