香菇多糖抗胃癌機制研究

馮 燕,全吉鐘,王冬旭,呂曉鵬

(吉化集團公司總醫院放化療科,吉林吉林 132022）

胃癌是我國常見的惡性腫瘤,全世界35%胃癌發生在中國,年發病30多萬,年胃癌死亡超過26萬。免疫治療可通過直接抑制腫瘤細胞及增強機體免疫功能等作用治療腫瘤,同時協同放化療可減輕放化療毒性。本研究通過香菇多糖對人胃癌細胞株BGC-823增殖活性、人胃癌細胞株BGC-823凋亡分子Bcl-2、BaxmRNA 及免疫抑制因子 TGF-β、VEGF mRNA表達及對小鼠脾細胞的增殖活性的影響探討其抗腫瘤的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

細胞株BGC823(人胃癌細胞株）,小鼠均為吉林大學基礎醫學部提供;主要實驗藥品:香菇多糖1 mg/2 ml,金陵藥業股份有限公司;PCR引物序列bax:上游引物:3'-gtccaccaagaagctgagc-5',下游引物:3'-agtagaagagggcaaccac-5';bcl-2上游引物3'-gacagaagatcatgccgtcc-5',下游引物3'-ggtaccaatggcacttcaag-5';TGF-β上游引物 3'-acctttgccgagggttcc-5',下游引物3'-tagatggcgttgttgcggt-5';VEGF上游引物3'-ttcatggatgtctatcagcg-5',下游引物3'-gctcatctctcctatgtgct-5'。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測細胞增殖活性 采用MTT比色分析。將對數生長期胃癌BGC823細胞株的細胞懸液調濃度至3×105/ml。取96孔平底培養板,設:①對照組(不加藥組）:共3復孔,每孔加無血清的DMEM培養液20 μ l,并每孔加入含 10%血清的DMEM培養液90 μ l;②加用香菇多糖組:共 6個濃度,分別為 1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000,從高到低進行稀釋,每個濃度3復孔,每孔加入20 μ l,并每孔加入含10%血清的DMEM培養液90 μ l。然后,各孔分別加入90 μ l細胞懸液。將培養板移入CO2培養箱中培養,在37℃5%CO2飽和濕度條件下孵育44 h后,各孔加入MTT溶液(5 mg/ml）10 μ l,繼續孵育 4 h后終止培養,小心吸棄孔內上清液,每孔加入 100 μ l DMSO,振蕩 10 min。選擇570 nm波長,在酶標儀上測定各孔光OD值,記錄結果,繪制表格。小鼠脾細胞增殖活性測定方法同上。

1.2.2 流式細胞術檢測細胞周期及凋亡 將對數生長期的胃癌細胞株BGC-823的細胞懸液調濃度至3×105/ml,接種于培養瓶中,設二組:①對照組;②香菇多糖作用組(終濃度為1∶10）。每組3瓶,在香菇多糖作用后48 h對細胞進行消化計數。以PBS洗三遍,調細胞濃度為1×106/ml,0.5 ml PBS重懸細胞,70%(體積分數）冰乙醇固定細胞過夜,加入RNAase至終質量濃度0.05 g/L,37℃恒溫水浴1 h,加入PI至終質量濃度0.05 g/L,4℃避光染色1 h,上流式細胞儀分析,使用200 mW氬離子激光,波長488 nm,資料用CELL TIL細胞周期分析軟件處理。檢測細胞周期及凋亡情況。

1.2.3 RT-PCR技術檢測凋亡分子及免疫抑制因子mRNA表達 將對數生長期胃癌細胞株BGC-823的細胞懸液調濃度至3×105/ml,接種于6孔板中,設二組:①對照組;②香菇多糖作用組(終濃度為1∶10）。每組3復孔,在37℃5%CO2恒溫培養箱中常規培養。在香菇多糖作用48 h時終止培養,收獲細胞,提總 RNA 并合成 cDNA。采用Bcl-2、Bax、TGF-β、VEGF各基因相應引物進行PCR擴增。反應結束后,各取8 μ l PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳,EB染色30 min,采用影像分析儀觀察結果。

1.2.4 統計學處理 各組實驗數據均用均數±標準差(ˉx±s）表示。兩組間差異顯著性分析用兩樣本均數差別的t檢驗,P＜0.05表示有顯著性差異。數據分析采用SPSS11.0軟件進行統計。

2 結果

2.1 香菇多糖對人胃癌細胞株BGC823增殖活性的影響

結果表明,1∶10濃度的香菇多糖作用于胃癌細胞BGC823能顯著抑制細胞增殖(P＜0.01）,見表1。

2.2 香菇多糖對人胃癌細胞株BGC-823細胞周期及凋亡的影響

香菇多糖作用于BGC-823細胞48 h后,G1期細胞比率由66.51%下降至65.75%,S期細胞比率分別由33.41%上升至34.08%,細胞增殖無明顯變化。香菇多糖可以促進胃癌細胞BGC823凋亡:在香菇多糖作用于胃癌細胞24 h后凋亡細胞百分比分別由0.55%增加至4.84%,結果見圖1。

2.3 香菇多糖對人胃癌細胞株BGC-823凋亡分子Bcl-2、BaxmRNA 及免 疫抑制因 子 TGF-β 、VEGF mRNA表達的影響

電泳結果顯示,相對于正常對照組細胞,香菇多糖組細胞中抑凋亡因子Bcl-2 mRNA表達明顯減少,促凋亡因子Bax mRNA表達明顯增加,并可下調人胃癌細胞株BGC-823免疫抑制因子TGF-β、VEGF mRNA,見圖 2。

表1 不同濃度LTN對胃癌細胞株BGC-823增殖的影響

圖1 香菇多糖對BGC-823細胞周期及凋亡的流式細胞術分析

圖2 香菇多糖作用前后胃癌細胞BGC-823中Bax,Bcl-2,VEGF、TGF-βmRNA 表達的影響

2.4 香菇多糖對小鼠脾細胞的增殖活性的影響

結果表明:1∶10濃度的香菇多糖對小鼠脾細胞細胞的增殖有顯著促進作用(P＜0.05）,見表2。

表2 LTN對小鼠脾細胞增殖活性的影響

3 討論

本實驗通過細胞與分子水平研究表明一定濃度香菇多糖可以通過上調促凋亡因子Bax、下調抗凋亡因子 Bcl-2的表達誘導腫瘤細胞凋亡,從而抑制胃癌細胞BGC-823的增殖;一定濃度香菇多糖可顯著促進小鼠脾細胞增殖活性發揮免疫調節作用;可下調人胃癌細胞株BGC-823免疫抑制因子VEGF、TGF-βmRNA的表達逆轉免疫抑制。

免疫藥物可增加患者的抗感染和抗腫瘤能力,國內賈均等對22例腫瘤放化療病人進行免疫治療結果顯示:不僅病人淋巴結細胞表型中CD3+,CD4+,CD4/CD8+升高,而且參與細胞凋亡的CD15+也有明顯增高.香菇多糖主要是通過增強誘導活化的巨噬細胞及CTL細胞,提高NK細胞活性和增強抗體依賴性巨噬細胞毒作用來發揮抗腫瘤作用。腫瘤細胞的發生、發展過程受多種因素影響,主要表現為細胞增殖失控、分化受阻、凋亡紊亂三個基本特征。目前一般認為,在惡性腫瘤發生和發展過程中,細胞凋亡抑制比細胞過度增殖所起的作用更重要。誘導腫瘤細胞分化、凋亡的相關研究也已成為近幾年的抗腫瘤研究的熱點之一。

免疫抑制因子可以不同程度抑制免疫細胞活性和抑制免疫效應的產生。腫瘤細胞自身亦可分泌、釋放一些具有免疫抑制作用的免疫抑制因子,如:VEGF、IL-10、TGF-β等直接參與機體的免疫抑制 ,且具有異質性,這些抑制因子積累聚集于腫瘤局部,形成一個較強的免疫抑制區,使進入其中的免疫細胞失活。同時免疫抑制因子VEGF還參與腫瘤新生血管的生成,VEGF及其受體(VEGFR）和VEGF的mRNA存在于多種腫瘤中,在腫瘤細胞,其表達量與腫瘤的惡性程度呈正相關。Bax與Bcl-2同族但功能相反,Bax具有促進細胞凋亡的功能,當Bax表達增加時,形成同源二聚體,促進細胞的凋亡。所以與一般癌基因和抑癌基因不同,Bcl-2和Bax不是通過調節細胞增殖,而是通過調控細胞凋亡來調節腫瘤細胞生長狀態的。與其起源組織相比,多數腫瘤的Bcl-2表達升高,而bax表達下降,Bax/Bcl-2比例下調在腫瘤的發生和發展中具有一定意義。

惡性腫瘤為基因突變的產物,因此探尋其發生發展以及治療,終需通過分子水平的研究來完成.本研究揭示了香菇多糖抗腫瘤效應及其分子機制,為香菇多糖輔助進展期胃癌術后放化療提供了理論基礎與實驗依據。

[1]羅榮成,韓煥興.腫瘤生物治療學[M].北京:人民衛生出版社,2006:224,260-265.

[2]游偉和.胃癌[M].北京:中國醫藥科技出版社,2006:113- 114;299-300.

[3]Tang Y,Katuri V,Srinivasan R,et al.Transforming Growth Factor-{beta}Suppresses Nonmetastatic Colon Cancer through Smad4 and Adaptor Protein ELF at an Early Stage of Tumorigenesis[J].Cancer Res,2005,65(10）:4228.

[4]Tavares Murta BM,Cunha Fde Q,Miranda R,et al.Diferential tumor microenvironment in human ovarian cystic tumors[J].Tumori,2004,90(5）:491.

[5]Chen J,Xu X,Charles BU,et al.Tachyplesin Activates the Classic Complement Pathway to Kill Tumor Cells[J].Cancer Res,2005,65(11）:4614.