β-連環(huán)蛋白和DNMT1在子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)的關(guān)系及意義

蘭翀，徐洪濤

（1.沈陽市婦嬰醫(yī)院婦科，沈陽 110011；2.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，沈陽 110001）

β-連環(huán)蛋白（β-catenin）既是細(xì)胞黏附分子，又是Wnt信號傳導(dǎo)通路激活的的關(guān)鍵，它作為一種癌基因，與結(jié)直腸癌［1］、肺癌［2］、子宮內(nèi)膜腺癌［3］等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。DNA甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活和腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要表觀遺傳學(xué)因素。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）的異常表達(dá)與結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［4］。但目前有關(guān)DNMT1在子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)和作用的研究還很少［5］，DNMT1與 β-catenin在子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)的關(guān)系和意義尚不清楚。為此，本研究采用免疫組化方法檢測DNMT1與β-catenin在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)情況和相互關(guān)系，及其與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理因素的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例與標(biāo)本：86例子宮內(nèi)膜腺癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本隨機(jī)選自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2007-2010年存檔石蠟組織標(biāo)本。患者平均年齡57.3歲（45～72歲），術(shù)前均未接受放化療。根據(jù)WHO（2004年）女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)分為子宮內(nèi)膜樣腺癌78例、漿液性腺癌4例、透明細(xì)胞癌4例，其中高分化52例、中分化20例、低分化14例。根據(jù)1988年國際婦產(chǎn)科協(xié)會（FIGO）子宮內(nèi)膜腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰa期10例，Ⅰb期44例，Ⅰc期28例，Ⅱ期2例，Ⅲ期2例。

1.1.2 試劑：鼠抗人DNMT1單克隆抗體（sc-70981）購自美國SANTA CRUZ生物技術(shù)公司，鼠抗人βcatenin單克隆抗體（610153）購自美國BD Transduction Laboratories，S-P超敏免疫組化試劑盒（KIT-9710）和DAB酶底物顯色試劑盒（DAB-0031）均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法

將石蠟包埋組織標(biāo)本制成4 μm切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯、水化后，進(jìn)行免疫組化染色，按試劑說明書操作，DNMT1和β-catenin一抗稀釋倍數(shù)均為1∶200，以PBS取代一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：每例標(biāo)本選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個癌細(xì)胞，計數(shù)陽性癌細(xì)胞占癌細(xì)胞總數(shù)的百分比。若β-catenin的細(xì)胞膜表達(dá)率≥10%則判定該例標(biāo)本為存在細(xì)胞膜表達(dá)；若細(xì)胞質(zhì)表達(dá)率≥10%則判定為異常細(xì)胞質(zhì)表達(dá)；若有超過10%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核表達(dá)，則判定為β-catenin核表達(dá)。本研究中，DNMT1在正常子宮內(nèi)膜組織中均為陰性表達(dá)，所以當(dāng)DNMT1的陽性表達(dá)率≥10%時，則判定該例標(biāo)本為DNMT1表達(dá)陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用χ2檢驗(yàn)和似然比法分析β-catenin、DNMT1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理因素的關(guān)系；采用Spearman等級相關(guān)分析DNMT1與β-catenin表達(dá)的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin的異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌的分化不良有關(guān)

本研究中，β-catenin在正常子宮內(nèi)膜腺體上皮中為細(xì)胞膜表達(dá)并伴有少量細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，未見細(xì)胞核表達(dá)，但在子宮內(nèi)膜腺癌中細(xì)胞膜表達(dá)顯著減少或消失，而細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核表達(dá)明顯增加。在86例子宮內(nèi)膜腺癌中，僅觀察到4例標(biāo)本存在β-catenin細(xì)胞膜表達(dá)，而有54例標(biāo)本（54/86，62.80%）出現(xiàn)β-catenin的細(xì)胞漿異常表達(dá)，其中有6例同時伴有細(xì)胞核表達(dá)（6/86，6.98%）。如表1所示，在中-低分化的子宮內(nèi)膜腺癌中，β-catenin的異常漿表達(dá)率（26/34，76.47%）明顯高于高分化的子宮內(nèi)膜腺癌組織（28/52，53.85%）（P=0.034）。β-catenin 的異常表達(dá)還與子宮內(nèi)膜腺癌的組織學(xué)類型有關(guān)（P=0.003），但與FIGO分期（P=0.246）和患者的年齡（P=0.105）無明顯關(guān)系。

2.2 DNMT1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌的分化程度和FIGO分期相關(guān)

正常子宮內(nèi)膜腺體中均未見DNMT1表達(dá)，而在子宮內(nèi)膜腺癌中則出現(xiàn)了不同程度的DNMT1陽性表達(dá)（38/86，44.19%）。如表1所示，在中-低分化的子宮內(nèi)膜腺癌中，DNMT1的陽性表達(dá)率（20/34，58.82%）明顯高于高分化的子宮內(nèi)膜腺癌組織（18/52，34.62%）（P=0.027）。而 FIGO 分期高的病例，DNMT1的陽性表達(dá)率也明顯高于FIGO分期低的病例（P=0.027）。另外，DNMT1的表達(dá)還與子宮內(nèi)膜腺癌的組織學(xué)類型有關(guān)（P=0.004），但與患者的年齡無明顯關(guān)系（P=0.531）。

2.3 β-catenin的異常表達(dá)與DNMT1的陽性表達(dá)相關(guān)

86例子宮內(nèi)膜腺癌病例中，54例出現(xiàn)βcatenin異常表達(dá)，而在這54例中有36例同時發(fā)現(xiàn)DNMT1的陽性表達(dá)，經(jīng)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)βcatenin的異常細(xì)胞質(zhì)表達(dá)與DNMT1的陽性表達(dá)顯著相關(guān)（r=0.588，P<0.001）。而 6例出現(xiàn) β-catenin核表達(dá)的子宮內(nèi)膜腺癌中也有4例為DNMT1陽性表達(dá)，但由于例數(shù)較少，未發(fā)現(xiàn)顯著的相關(guān)性（r=0.124，P=0.255）。

圖1 β-catenin和DNMT1在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá) 免疫組化S-P法×400Fig.1 The expressions of β-caten in and DNM T1 inendom etrial adenocarcinom atissues Immunoh istochem istryS-P method×400

表1 β-catenin和DNMT1的表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理因素的關(guān)系Tab.1 The relat ionships between β-catenin，DNMT1 expressi on and clini copat hologic characteri stics of endom etria lcancer

3 討論

子宮內(nèi)膜腺癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%［6］。Wnt信號傳導(dǎo)通路的激活可能在子宮內(nèi)膜腺體的惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了重要作用［7］。β-catenin在細(xì)胞質(zhì)、核內(nèi)的異常蓄積是Wnt通路激活的關(guān)鍵。而β-catenin蓄積的主要原因可能是其基因CTNNB1第3外顯子的突變或APC-Axin-GSK3降解復(fù)合體的功能障礙［1，2］。有報道在子宮內(nèi)膜腺癌中發(fā)現(xiàn)了β-catenin的細(xì)胞核蓄積和其基因CTNNB1的突變［3，8］。本研究中，β-catenin在子宮內(nèi)膜腺癌中的異常細(xì)胞漿表達(dá)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，并在6例標(biāo)本中出現(xiàn)了細(xì)胞核表達(dá)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)β-catenin的異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌的低分化程度相關(guān)，與以往的研究相似［9］，表明子宮內(nèi)膜腺癌中存在β-catenin的異常蓄積和Wnt通路的激活，并參與了子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展中。

有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中APC、Dab2等Wnt信號通路的抑制基因有啟動子甲基化的現(xiàn)象［10］。而啟動子甲基化就可能導(dǎo)致APC等抑癌基因表達(dá)下調(diào)，從而引起β-catenin異常蓄積和Wnt通路激活。DNMT是調(diào)控DNA甲基化的關(guān)鍵分子，與惡性腫瘤中抑癌基因的甲基化、失活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)［4］。那么，DNMT1的表達(dá)是否與β-catenin的蓄積和Wnt通路的激活有關(guān)呢？目前有關(guān)DNMT1在子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)的研究較少［5］，尚未見DNMT1與β-catenin在子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)關(guān)系的報道。為此，本研究檢測了DNMT1在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)情況，并分析其與β-catenin蓄積的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNMT1在癌組織中的表達(dá)顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織，并與子宮內(nèi)膜腺癌的低分化程度和高FIGO分期有關(guān)。更重要的是，本研究首次發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜腺癌中，DNMT1與β-catenin的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)顯著正相關(guān)，這表明二者之間存在著直接或間接的協(xié)同作用。腫瘤中DNMT1的表達(dá)增加有可能通過促進(jìn)APC、Axin等抑癌基因的甲基化，從而促進(jìn)βcatenin的失調(diào)控和蓄積，另外，β-catenin也可能通過多種靶基因產(chǎn)物直接或間接地促進(jìn)DNMT1的表達(dá)。二者可能具有相互調(diào)控、相互協(xié)同，共同促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺癌進(jìn)展的作用，有待今后深入研究。

綜上所述，β-catenin的異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌的低分化程度相關(guān)；DNMT1的陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌的低分化和高FIGO分期相關(guān)；DNMT1與βcatenin的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)顯著正相關(guān)。深入研究DNMT1和Wnt信號通路之間的表達(dá)調(diào)控機(jī)制將有可能為在子宮內(nèi)膜腺癌的診斷和基因靶向治療提供新的線索和思路。

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