GST-LMO1融合蛋白表達載體的構建及其在原核細胞中的表達

顧卉，佟宇鑫，劉彤，李慧，李丹妮，袁正偉

（中國醫科大學 1.附屬盛京醫院實驗研究中心；2.基礎醫學院細胞生物教研室，細胞生物學教育部、衛生部重點實驗室；3.第9 4期臨床醫學系，沈陽 1 1 0 0 0 1）

LMO家族是只包含LIM結構域的一類蛋白，由兩個串聯的LIM結構域構成。LIM結構域，大約有55個氨基酸，是一種高度保守的半胱氨酸富集的鋅指結構基序。LMO家族包括4個成員（LMO1~4），其中LMO1是重要的一員，其編碼序列全長為470個堿基，編碼157個氨基酸。LMO1在核內與其它轉錄因子結合，參與細胞譜系的決定、細胞分化的調節、細胞增殖的控制。研究表明，LMO1與急性T淋巴細胞白血病、神經母細胞瘤及胃癌的發生發展密切相關［1~3］。

LMO1中的LIM結構域可作為蛋白質相互作用的表面，與其他蛋白如轉錄調節因子結合形成復合體，來間接影響基因的轉錄活性，因而成為細胞核內的輔助轉錄因子［4］。本研究旨在構建LMO1基因全長及其截短突變體的原核表達載體，并在原核細胞大腸埃希菌E.coli中表達其融合蛋白，為LMO1的結構功能及其信號通路的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體pGEX-5X-2購自美國Clontech公司；E.coliDH5α和BL21均由實驗室自行制備；PyrobestTMDNA聚合酶、BamHⅠ和EcoRⅠ內切酶、T4 DNA連接酶、電泳凝膠回收試劑盒均購于NEB公司；DNA marker、Protein marker 購于南京金斯瑞公司；異丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）購于Amresco公司；抗GST單克隆抗體購于Cell Signaling公司；HRP標記的羊抗鼠第二抗體購于中山公司；ECL試劑盒購于GE公司。引物合成與DNA序列測定由南京金斯瑞公司完成。

表1 構建L MO 1全長及截短突變體原核表達質粒所用引物序列T a b.1 T h e p r i me r s o f t h e p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n p l a s mi dL MO 1a n d i t s d e l e t i o n mu t a n t s

1.2 全長及截短突變體原核表達載體的構建

以質粒pcDNA-3.1/His A-LMO1為模板，PCR擴增LMO1基因全長及其截短片段（圖1），所用PCR擴增引物見表1。PCR反應條件為95℃預變性5 min后，進行如下循環：95℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，循環30次，72℃再延伸10 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收PCR產物后，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，再次電泳純化回收后，與同樣經過BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切的原核表達載體pGEX-5X-2連接，4℃過夜后轉化E.coliDH5α感受態細胞，37℃培養過夜后，挑取單克隆菌落，接種并培養過夜。用堿裂解法提取質粒后，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確，經進一步測序證實序列正確無突變后，將LMO1基因全長質粒命名為FL，各截短突變體質粒分別命名為A~E。

1.3 重組蛋白在原核細胞中的誘導表達

將全長及截短突變體質粒分別轉化至感受態細胞E.coliBL21中，37℃培養過夜。挑取單克隆菌落，接種并37℃培養過夜，1∶200稀釋菌液后繼續培養至OD600為0.6左右時，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導劑IPTG，30℃誘導3 h后，收集菌液，進行SDS-PAGE電泳。將PAGE膠進行考馬斯亮藍染色，再經脫色后觀察結果。

1.4 Western blot分析

將誘導成功的融合蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，4℃轉膜過夜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 洗膜 3次，10 min，加入抗 GST 抗體（1∶1 000），室溫慢慢搖晃雜交2 h，TBST洗膜3次，10 min，加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗（1∶5 000），室溫慢慢搖晃雜交1 h，TBST洗膜3次，10 min，ECL發光。

2 結果

2.1 LMO1全長及截短突變體原核表達載體的構建及鑒定

將構建的LMO1原核表達質粒FL，A~E經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切并瓊脂糖凝膠電泳后分別得到約 5 kb 及 480，249，189，222，180，372 bp 的兩條帶，與預期結果一致（圖2）。經進一步DNA測序鑒定序列正確，無突變。

圖1L MO 1及其截短突變體模式圖F i g.1 S c h e ma t i c d i a g r a ms o fL MO 1a n d t h e i r d e l e t i o n mu t a n t s

圖2 重組質粒F L，A~E經B a mHⅠ/E c o RⅠ雙酶切鑒定電泳結果F i g.2 B a mHⅠ/E c o RⅠd i g e s t i o na n de l e c t r o p h o r e s i sa n a l y s i so f t h e p l a s mi d s F L，A~E

2.2 LMO1重組質粒在原核細胞E.coli中的誘導表達

將LMO1重組質粒FL，A~E分別轉化至E.coli BL21中，挑取單克隆，在 1 mmol/L IPTG，30℃，3 h的條件下誘導表達，經10%SDS-PAGE電泳進行分離，考馬斯亮藍染色后分別在 43，35，32，34，32 和39 kDa附近出現明顯的特異性條帶，其分子量分別與預期的重組融合蛋白FL，A~E相符（圖3）。

2.3 GST-LMO1重組融合蛋白的Western blot鑒定

Western blot法鑒定LMO1全長及截短突變體融合蛋白的表達。結果可見在分子量分別約為43，35，32，34，32 和 39 kDa附近出現特異性條帶（圖4），為LMO1全長及截短片段分子量（分別為17，9，6，8，6和 13 kDa）與原核載體 pGEX-5X-2 中 GST 分子量（26 kDa）之和，說明LMO1的全長與截短突變體重組融合蛋白正確表達。

3 討論

圖3 S D S-P A G E分析G S T-L MO 1融合蛋白在原核細胞中的表達F i g.3 S D S-P A G Ea n a l y s i so f t h ee x p r e s s i o no f G S T-L MO 1f us i o n p r o t e i n s i n p r o k a r y o t i c c e l l

圖4 We s t e r nb l o t法分析G S T-L MO 1全長及其截短突變體融合蛋白的表達F i g.4We s t e r nb l o t a n a l y s i so f G S T-L MO 1f u l l l e n g t ha n di t s d e l e t i o n mu t a n t f u s i o n p r o t e i n s

LMO是僅含LIM結構域的單純LIM蛋白家族中的一類，它含有一個或多個LIM結構域。LIM結構域是一種高度保守的半胱氨酸富集的鋅指結構基序，是胚胎發育過程中的重要調節蛋白，在決定細胞命運、控制細胞生長及分化中起著關鍵的作用［5］。研究證實，LMO1與腫瘤的發生發展有密切關系：過表達LMO1的轉基因鼠發育不成熟，形成急性T淋巴細胞白血病，提示它是T淋巴細胞白血病的原癌基因［6］；有報道表明LMO1與神經母細胞瘤的發生發展密切相關［2］；并且參與胃癌中的凋亡過程［3］。

為了研究LMO1的結構與生物學功能，獲得LMO1純化蛋白，根據LMO1全長及截短序列，設計了6對特異性的引物，并在引物中引入了BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，以質粒pcDNA-3.1/His ALMO1為模板，擴增出LMO1基因全長及其截短突變體序列，利用酶切電泳鑒定以及DNA測序的方法，證實了pGEX-5X-2-LMO1全長及其截短突變體重組質粒構建成功。并在IPTG誘導下表達了其重不好；膽堿酯酶復能劑吸收差，且只能在72 h內應用，對已經老化的膽堿酯酶無效。因此，尋找一種新的更為有效的減少有機磷中毒的死亡率和致殘率的藥物是該領域研究中急待解決的關鍵問題。上世紀80年代，人們提出有機磷生物清除劑的概念，即在有毒的有機磷到達靶器官前能夠鰲合或中和它們的酶或拮抗劑，并且用很小的量就可以達到有機磷清除的目的。提出清除劑的理論后，人們把目光聚焦在對PON1—哺乳動物血漿內的一種在有機磷中毒的自然防御中發揮作用的天然催化清除劑，并稱之為最有前景的有機磷生物清除劑［1，8，9］。

本研究中，DDVP毒代動力學的結果支持PON1可以水解DDVP，降低DDVP的血中濃度。但應用阿托品+PAM-CL后，血中DDVP濃度并沒有降低。這說明阿托品+PAM-CL對DDVP沒有水解作用，與之前的研究相一致。同時，PON1與阿托品+PAM-CL聯合應用也沒有比單獨應用PON1水解療效強，因此，PON1聯合應用阿托品+PAM-CL對PON1的催化水解作用沒有藥物間相互作用，所以兩種方法可以在臨床上聯合應用。

AUC、MRT和Cmax是評價毒代動力學的重要指標，AUC值用來評價藥物的入血量，MRT用來評價藥物在體內的保留時間，Cmax用來評價藥物在體內的最高濃度。本研究結果顯示，與染毒組大鼠相比，應用PON1后，AUC值明顯降低，Cmax明顯減小，體內DDVP的入血量明顯降低，峰濃度降低。但對平均保留時間影響不大。

綜上所述，純化兔血清PON1可以明顯改善大鼠體內膽堿酯酶抑制水平，并可以明顯降低DDVP入血量，降低峰濃度。

［1］Rochu D，Chabrière E，Masson P.Human paraoxonase：a promising approach for pre-treatment and therapy of organophosphorus poisoning［J］.Toxicology，2007，233（1-3）：47-59.

［2］ Costa LG，Cole TB，Furlong CE.Polymorphisms of paraoxonase（PON1）and their significance in clinical toxicology of organophosphates［J］.J Toxicol Clin Toxicol，2003，41（1）：37-45.

［3］Aharoni A，Gaidukov L，Khersonsky O，et al.The “evolvability”of promiscuous protein functions［J］.Nat Genet，2005，37（1）：73-76.

［4］ Khersonsky O，Tawfik DS.Structure-reactivity studies of serum paraoxonase PON1 suggest that its native activity is lactonase［J］.Biochemistry，2005，44（16）：6371-6382.

［5］Maxwell DM，Brecht KM，Chang F，et al.Toxicodynamic modelling of highly toxic organophosphorus compound［J］.J Mol Neurosci，2006，30（1-2）：129-131.

［6］趙敏，崔玥，袁麗.純化兔血清對氧磷酶的萃取和純化［J］.中國醫科大學學報，2009，38（7）：490-492.

［7］Eckerson HW，Romson J，Wyte C，et al.The human serum paraoxonase polymorphism：identification of Pphenotypes by their response to salts［J］.Am J Hum Genet，1983，35（2）：214-227.

［8］Shigeaki I，Takeshi S，Hiroyasu M，et al.Rapid simultaneous determination for organophosphorus pesticides in human serum by LC-MS［J］.J Pharma Bio Ana，2007，44（1）：258-264.

［9］Voss G，Sachsse，K.Red cell and plasma cholinesterase activities in microsamples of human and animal blood determined simultaneously by a modified acetylthiocholine/DTNB procedure［J］.Toxicol Appl Pharmacol，1970，16（3）：764-772.