基質金屬蛋白酶蛋白在百草枯致肺纖維化大鼠肺組織中表達及其意義

杜妍，肖莉

（中國醫科大學附屬盛京醫院急診科，沈陽 110004）

百草枯（paraquat，PQ）為有機雜環類接觸性脫葉劑及除草劑，對人有較強毒性，目前中毒機制尚不明確，無特效治療方案。基質金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類主要降解細胞外基質成分的蛋白酶，在生理和病理過程中發揮著重要的作用。近年來隨著研究的深入，發現MMP3、MMP8與肺纖維化有著密切的聯系［1］。研究發現腹腔注射百草枯可致大鼠肺纖維化，此病理過程與人類百草枯致肺纖維化過程極其相似，因此，本實驗研究百草枯對肺組織病理改變的影響，進一步研究MMP3、MMP8在百草枯致急性肺損傷及纖維化肺組織中的表達及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠購自中國醫科大學附屬盛京醫院實驗動物中心。百草枯（99.99%，貨號：856177-1G）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。MMP3（貨號：bs-0413R）、MMP8（貨號：bs-1913R）抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 動物模型的建立、分組及標本處理

雄性 SD 大鼠40只，SPF 級，體質量（295±20）g，隨機分為模型組（PQ組）和鹽水對照組（NS組），每組20只。NS組一次性腹腔注射生理鹽水8.5 mL/kg。PQ組一次性腹腔注射百草枯15.0 mg/kg。分別于給藥后5 d、28 d處死動物，HE染色觀察肺纖維化程度，免疫組化法觀察各組動物MMP3、MMP8蛋白表達。

1.3 肺泡炎癥、肺纖維化程度判斷

肺組織石蠟切片HE染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。按照Szapiel等［3］的方法評價肺組織病理變化嚴重程度，評分標準如下：無肺泡炎或無纖維化且肺組織受累面積為0記為“-”；輕度肺泡炎或纖維化且肺組織受累面積<20%記為“+”；中度肺泡炎或纖維化且肺組織受累面積20%～50%記為“++”；重度肺泡炎或纖維化且肺組織受累面積>50%記為“+++”。

1.4 免疫組化法檢測肺組織MMP3、MMP8蛋白表達

肺組織石蠟切片常規脫蠟至水，然后按免疫組化試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學處理

采用SPSS 17.0版統計軟件，肺組織HE染色肺泡炎或纖維化程度資料用秩和檢驗Ridit方法，Ridit法是將按等級分組的資料，通過轉換成為一組連續性的計量資料，計算Ridit值（簡稱R值），屬于一種非參數統計方法。肺組織免疫組化法觀察MMP3、MMP8蛋白表達資料以±s表示。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織的病理學改變

對照組大鼠肺臟外觀大致正常，鏡下未見炎性細胞浸潤和膠原沉積。模型組大鼠5 d時肺組織外觀明顯腫脹，鏡下示肺泡間隔明顯增寬變形，肺泡間隔和肺泡腔內重度炎性細胞浸潤，以單核/巨噬細胞為主，大部分形成炎癥灶，成纖維細胞增多，病灶內已出現肺泡萎縮。28 d時外觀呈蒼白色，腫脹已基本消退，體積縮小，彈性更差，硬度增加，表面呈結節樣改變并可見條索狀凹溝，鏡下可見肺泡結構破壞，成纖維細胞大量增生，纖維組織呈條索樣瘢痕改變，斑片狀分布，但外周肺實質炎癥有更進一步的吸收（表 1，圖 1）。

表1 各組大鼠肺組織H E染色肺泡炎或纖維化程度（n）Tab.1 HE staining of lung tissue of rats alveo litis orfibrosis（n）

圖1 各組大鼠肺組織H E染色的動態變化 ×200Fig.1 The HE staining of lung tissue dynam ics×200

2.2 免疫組化法檢測MMP3、MMP8在大鼠肺組織內的分布

MMP3、MMP8在正常組大鼠肺組織內呈弱表達。模型組大鼠5 d時肺組織中MMP3、MMP8的表達增強，到28 d時已基本達到正常水平（表2，圖2、3）。

表2 各組大鼠肺組織免疫組化法觀察MMP3、MMP8蛋白表達（O D值）Tab.2 Rats ineach group immunohist ochemistry inlung tissue was observed mmP3，M M P8prot ei n expressi on（O D val ue）

圖2 各組大鼠肺組織免疫組化法觀察MMP3蛋白表達動態變化（200×）Fig.2 Lung tissue of rats ineach group were observed by immunoh is tochem istry MM P3 prote in dynam ics（200×）

圖3 各組大鼠肺組織免疫組化法觀察MMP8蛋白表達動態變化 ×200Fig.3 Lung tissue of rats in each group were observed by im munoh istochem istry MM P8 protein dynam ics×200

3 討論

百草枯化學名為 1，1′-二甲基 4，4′-聯吡啶陽離子鹽，為有機雜環類接觸性脫葉劑及除草劑［3］。百草枯對人有較強毒性，由于其中毒致死量小、無特效解毒劑、常規對癥治療效果極差，故死亡率較高，國外報道百草枯中毒病死率40%～50%［4］。重度中毒患者可在短時間內死于多臟器功能衰竭，中度中毒時主要損害肺臟，對人有較強毒性，在對人體的損害中主要表現為肺組織的損傷，PQ經胃腸道吸收入血后通過多胺攝取途徑可特異性聚集于肺臟，濃度比血液高6～10倍［5］，患者于染毒后24 h迅速出現肺水腫、肺出血及肺不張等急性肺損傷癥狀，并進行性發展為急性呼吸窘迫綜合征，患者如能度過1周左右的急性期，肺部損傷逐漸加重，發展為不可逆的肺間質纖維化，后期多死于呼吸衰竭［6］。肺纖維化的病理特征是肺泡上皮的損傷和成纖維細胞增殖，目前發病機制尚不清，目前對百草枯中毒機制的研究主要集中在以下幾方面：氧自由基損傷、炎性細胞浸潤、細胞因子及趨化因子、基因異常表達等方面。

MMPs是一類主要降解細胞外基質成分的蛋白酶，在生理和病理過程中發揮著重要的作用。MMPs是一類高度保守的鋅離子依賴內肽酶家族，至少有26種人類MMPs［7］。MMPs可以分為3個結構區域：N端的前肽區，催化區和C端的類血結區。MMPs以無活性形式合成，被激活后才有活性。MMPs主要通過兩種途徑被激活，其一是N端的前肽區變構或轉位，其二是N端的前肽區被酶切。它們被激活后能夠降解細胞外基質蛋白，同時也可以降解非細胞外基質成分蛋白，如生長因子、細胞因子、趨化因子、細胞受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑和其他蛋白酶，從而調節這些化合物的生物活性。基質金屬蛋白酶的這一作用可以預防或引發疾病，如癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病、神經退行性疾病和各種結締組織病［8］。多位學者在PQ致肺纖維化機制研究中發現某些基因表達異常，目前研究最多的是MMP2和MMP9，認為它們是降解肺泡基膜主要成分IV型膠原的主要酶類，對肺組織的重構有不可忽視的作用。與此同時對MMP3、MMP8的研究相對較少。Tomita等［4］對C57Black/6J大鼠鼻內飼入不同劑量PQ，實驗結果表明在染毒后的5 d內，肺纖維化尚未形成，但已經有基因表達的改變，其中包括MMP3和MMP8，因此本實驗研究 MMP3、MMP8，探討 MMP3、MMP8與肺纖維化之間的關系。結果提示，肺纖維化的發生與MMP3、MMP8的異常表達直接相關，提示它們可能是PQ致肺纖維化的標志物。

綜上所述，MMP3、MMP8蛋白在百草枯誘導肺纖維化大鼠肺組織中的表達增強，后進行性下降至實驗終點（染毒后28 d）時基本接近正常，提示MMP3、MMP8可能是PQ致肺纖維化的標志物，對MMP3、MMP8的檢驗將具有重要的臨床意義并進一步指導治療。但本實驗并未深入的研究MMP3、MMP8參與肺纖維化的分子生物學機制，這將是我們下一步實驗工作的重點。

［1］Tomita M，Okuyama T，Katsuyama H，et al.Mouse model of paraquatpoisoned lungs and its gene expression profile［J］.Toxicology，2007，231（2-3）：200-209.

［2］陶章，李惠萍.不同劑量博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的比較［J］.中國組織工程研究生與臨床康復，2009，13（7）：1214-1218.

［3］Serra A，Domingos F，Prat MM.Paraquatintoxication ［J］.Acta Med Port，2003，16（1）：25-32.

［4］Hwang KY，Lee EY，Hong SY.P araquat intoxication in Korea［J］.Arch Environ Herlth，2002，57：162-167.

［5］Shimada H，Hirai K，Simamura E，et al.Paraquat toxicity induced by voltage-dependent anion channel 1 acts as an NADH-dependent oxidoreductase［J］.J Biol Chem，2009，284（42）：28642-28649.

［6］Dinis-Oliveira RJ，Duarte JA，Sanchez-Navarro A，et al.Paraquat poisonings：mechanisms of lung toxicity，clinical features，and treatment［J］.Toxicol，2008，38（1）：13-71.

［7］唐瑩.Mmp2、Mmp3與肺癌及肺纖維化的研究進展［J］.實用癌癥雜志，2009，24（1）：91-92.

［8］Hadler-Olsen E，Fadnes B.Regulation of matrix metalloproteinase activity in health and disease［J］.FEBS J，2011，278（1）：28-45.