應用免疫蛋白質組學方法鑒定日本血吸蟲蟲卵診斷抗原＊

王 越，楊再峰，馬 安，施曉華，陳璋輝，劉曉龍，干小仙

應用免疫蛋白質組學方法鑒定日本血吸蟲蟲卵診斷抗原＊

王 越1，楊再峰2，馬 安1，施曉華1，陳璋輝1，劉曉龍1，干小仙1

目的 蟲卵可溶性抗原（soluble egg antigen，SEA）是目前日本血吸蟲病免疫診斷中最常用的抗原。本研究聯合應用雙向凝膠電泳（2－DE）、Western blot和MALDI－TOF質譜等技術，鑒定SEA中診斷抗原蛋白質。方法 SEA經2－DE分離蛋白質后進行銀染，或應用日本血吸蟲感染兔血清Western blot篩選抗原蛋白點，用MALDI－TOF/TOF串聯質譜鑒定每一抗原蛋白質分子。結果 蟲卵可溶性蛋白分子經2－DE分離后轉印PVDF膜上，與感染兔血清孵育出現29個特異性陽性反應點，與健康兔血清出現3個非特異的陽性反應點；29個特異性抗陽性反應點中，從銀染2－DE膠圖上找到21個匹配的抗原蛋白質點；MALDI－TOF/TOF質譜鑒定和 NCBI數據庫檢索，13個點（61.9%）獲得匹配蛋白質，4個點（19.0%）獲得匹配EST，4個點（19.0%）未能從數據庫中找到相匹配的信息。重組表達篩選出的SjCHGC06040和SjP40兩個抗原蛋白質，Western blot結果顯示reSjCHGC06040、reSjP40均能與感染兔血清抗體發生特異性反應，具有潛在的應用價值。結論 2－DE、MALDI－TOF質譜聯合Western blot的免疫蛋白質組學研究方法，用于篩選、鑒定SEA中診斷抗原蛋白質，是切實可行的；但該方法存在一定的局限性，有待進一步改進。

日本血吸蟲；蟲卵可溶性抗原；免疫蛋白質組學

中國是日本血吸蟲肆虐最嚴重的國家，經過幾十年的防治，大部分地區疫情得到控制或基本控制，流行區人體感染率和感染度逐步下降。但是，迄今仍有7省市存在不同程度流行，局部地區人群感染率出現回升，尋找更適合我國血吸蟲病流行現狀的防制新技術是當前亟待研究的內容［1］。近10年來，日本血吸蟲和曼氏血吸蟲的基因組、轉錄組研究取得重大突破，已基本完成基因組草圖，同時積累了龐大的生物信息資料［2－3］，這為血吸蟲病防制新技術研究開創了新局面。

糞檢蟲卵曾是最常見、最經濟、最可靠的日本血吸蟲病查病方法。但隨著防治工作的深入，人體感染率、感染度已降至較低水平，用糞檢蟲卵等病原學查病方法從龐大的流行區人群中將感染者篩查出來，不僅費時、費力，并且容易造成漏檢。因此，需要建立操作簡易并且敏感、特異的診斷技術替代病原學檢查［4］。2008年對全國血吸蟲病免疫診斷試劑進行評估，結果顯示9種采用蟲卵可溶性抗原（Soluble egg antigen，SEA）檢測特異性IgG抗體的方法，敏感性均在92%以上，能基本滿足人群篩查要求，但特異性為70%～97.1%不等［5］。為尋找適合新型診斷技術的特異性抗原分子，本文將經典的高分辨率的蛋白質分離技術雙向凝膠電泳（2－DE）與Western blot相結合，從SEA中篩選抗原蛋白質分子，再利用MALDI－TOF質譜和血吸蟲生物信息資料鑒定抗原蛋白質。

1 材料與方法

1.1 動物 日本血吸蟲感染陽性釘螺由江西省寄生蟲病研究所提供，逸放尾蚴前先在30～35℃恒溫箱孵育7d；健康新西蘭家兔，體重2.5～3.0kg，雄性，由浙江省實驗動物中心提供。

1.2 日本血吸蟲蟲卵收集 用潔凈蓋玻片蘸取新逸出的日本血吸蟲尾蚴，貼于健康家兔腹部皮膚進行人工感染，每兔約2 000條。感染后43d剖殺，取肝臟組織，剪碎后研磨成勻漿，按Ashton PD等［6］介紹的蛋白酶消化結合不同目數的銅篩淘洗分離獲得純凈蟲卵，分裝后－80℃備用。

1.3 蟲卵可溶性蛋白樣本制備 取凍存的日本血吸蟲蟲卵樣品，用細胞洗滌液洗滌2～3次后，置組織勻漿器中，加入適量預冷的細胞裂解液反復研磨，蟲卵勻漿液移至PV管中，冰浴上超聲粉碎5min（80W×5s×5次，每次間隔10s），4℃條件下30 000g離心45min，收集上清，按Bradford法測定蛋白濃度，分裝后－80℃備用。

1.4 雙向電泳 采用13cm IPG 膠條（pH 3－10），上樣蛋白量300μg，水化液體積300μL。第一向等電聚焦，設置程序：30V水化12h，500V除鹽1h，1 000V除鹽1h，8 000V線性升壓8h，8 000V快速聚焦35 000Vh，500V保持任意時間。第二向SDS－PAGE：丙烯酰胺膠濃度為12%，將聚焦好的IPG膠條置于PAGE凝膠上端，與凝膠緊密相接，再用0.5%瓊脂糖/溴酚藍封膠條，220V恒壓6h。電泳結束后取下凝膠，置去離子水中漂洗2次。1個樣本1次同時同樣條件做3塊膠，2塊膠分別作電轉印，1塊膠進行銀染色及質譜鑒定用。

1.5 Western blot 按半干轉印儀（Trans－Blot SD Semi－Dry Transfer Cell，BIO－RAD）操作說明進行。電轉印條件：24V/膠，30min。轉印膜浸泡于5%脫脂奶粉中，4℃封閉過夜，TBST洗滌3次，每次10min；同一樣本相同條件下電泳、轉印的2張膜，分別與1∶200稀釋的混合感染兔血清和混合健康兔血清在室溫下孵育1h，TBST洗膜3次，每次10 min；加入1∶40 000稀釋的羊抗兔IgG堿性磷酸酶標記物，室溫孵育1h；TBST洗膜3次后加入20 mL/氯化硝基四氮唑藍（5－bromo－4－chloro－3－indolyl phosphate/nitro－blue tetrazolium chloride，BCIP/NBT）底物溶液，避光反應10min，用20mmol/L EDTA溶液洗滌終止反應，結果掃描保存。

1.6 質譜鑒定

1.6.1 抗原蛋白點膠內消化 根據PVDF膜上特異性陽性反應點，在銀染色的2－DE膠圖上找到相匹配的抗原蛋白質點。手工挖點，用30%乙腈和100mmol/L的NH4HCO3將選定的蛋白質點膠粒脫色至膠塊無色透明，吸去脫色液后低壓凍干，加入30μL含50ng胰蛋白酶的50mmol/L NH4HCO3中水化，37℃消化過夜。用含0.1%三氟乙酸的60%乙腈提取3次，收集所得肽段低壓凍干，－80℃保存待用。無蛋白的膠顆粒按上述方法處理后用作陰參，以鑒定由胰蛋白酶自體酶解產生的產物。

1.6.2 MALDI－TOF/TOF－MS/MS鑒定 MALDI－TOF/TOF質譜鑒定：先用標準肽外標校正ABI 4800Proteomics Analyzer質譜儀，選定5個離子強度最強的肽段作為母離子用于MS/MS串聯質譜測序。質譜儀基本參數：波長為355nm，頻率200Hz，在正離子反射模式下每張圖譜為1 000次激光打擊，離子源加速電壓20kV，質量范圍為800～4 000Da，信噪比最小值為10，本底噪音窗寬度為250m/z時自動確定單同位素峰質量。選定在MS/MS正離子模式下設定默認標準曲線，碰撞能量2kV。所有實驗樣品的質譜圖均以默認模式獲得。利用軟件Mascot distiller過濾基線峰、識別信號峰。將分析獲得的MS及MS/MS數據利用GPS搜索引擎及Matrix Science公司的Mascot軟件搜索NCBInr數據庫，尋找匹配的相關蛋白質，同時查詢其功能。

1.7SjP40、SjCHGC06040抗原的重組表達 按RNA提取試劑盒操作說明書提取日本血吸蟲蟲卵總RNA。根據SjP40和SjCHGC06040的cDNA序列分別設計、合成1對引物，并插入酶切位點。SjP40：P1：GCGGATCC（BamH I）TTTCCGAGGCATAGACACGA，P2：GCGAATTC（EcoR I）TTATTTCTTGCCACCTGCACCAT；SjCHGC06040： P1：GCGGATCC （BamH I）AGCGAGTTTGTGC TTCACAAACC，P2：TATGCGGCCGC （NotI）TCACTTAGGTTGAT－CAATACGTACCA。以提取的總RNA為模板，應用oligo（dT）引物和逆轉錄酶RT－PCR合成cDNA，再以此為模板，分別加入SjP40和SjCHGC06040引物，擴增目的基因。PCR產物經BamH I/EcoR I （SjP40） 和BamH I/NotI（SjCHGC06040）雙酶切后連接到pET28a載體，將連接產物分別轉化E.coliTOP10感受態細胞。取轉化產物涂布Kan陽性平板，37℃培養過夜。每個平板挑選10個克隆進行Colony PCR，1%Agarose凝膠電泳驗證重組載體。選擇Colony PCR陽性的克隆送測序檢測。測序結果正確者小量培養抽提質粒，將質粒轉化到E.coliRossetta（DE3）感受態細胞，涂布Kan陽性平板，37℃培養過夜，挑選單個白色克隆，接種于LB培養基，于37℃振蕩培養OD600達到0.8左右時加入IPTG至終濃度為1mmol/L，誘導表達4h后收菌。收集的細菌經洗滌后，用細胞裂解液及超聲粉碎破菌，取上清液，采用Ni－NAT層析柱純化重組蛋白。用SDS－PAGE檢測蛋白表達和純化結果。

1.8 reSjP40和reSjCHGC06040抗原性檢測 純化的reSjP40和reSjCHGC06040重組蛋白經SDSPAGE電泳后轉印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，分別與anti－His單抗、感染兔血清、健康兔血清孵育，洗滌后分別與堿性磷酸酶標記的抗鼠IgG、抗兔IgG二抗孵育，BCIP/NBT底物顯色反應10～15min。

2 結 果

2.1 2－DE和2－DE Western blot圖譜 日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原2－DE獲得＞200個蛋白質點，與感染兔血清反應的Western blot出現29個陽性反應點，與健康兔血清孵育反應出現3個假陽性點（由紅色虛線圈標示）；29個陽性反應點在相應2－DE膠圖上找到21個匹配蛋白質點；其中81.0%（17/21）抗原蛋白質點分子量主要分布在31～66.2kDa之間，5個抗原點分子量在14.4～20.1kDa之間；8個（26.7%）陽性反應點未能在2－DE膠圖上找到匹配蛋白質點。

2.2 抗原蛋白質點 MALDI－TOF/TOF－MS/MS分析及搜庫結果 21個抗原蛋白點經MALDITOF質譜鑒定，13個點（61.9%）從NCBI數據庫找到匹配蛋白質，相關信息資料詳見表1；4個點（13、16、18、21）僅從NCBI EST數據庫找到匹配的序列；4個點（9、15、19、20）未能從數據庫中找到相匹配的信息，占19.0%。

2.3SjP40和SjCHGC06040抗原基因重組表達SjP40和SjCHGC06040基因經PCR擴增產生分別為744bp和909bp的片段，并成功克隆至pET28a載體。重組質粒經測序后與SjP40（GI：226477158）和SjCHGC06040（GI：76156146）序列進行比對，同源性分別達到99.6%和99.0%。轉化后的E.coli表達菌經IPTG誘導表達預期分子量的重組蛋白，結果見圖2。

2.4 reSjP40和reSjCHGC06040免疫印跡結果純化的reSjP40和reSjCHGC06040均與日本血吸蟲感染兔血清有較強反應，而與健康兔血清未見反應，見圖3。

圖1 日本血吸蟲可溶性抗原2－DE膠圖和Western blot結果A：日本血吸蟲可溶性抗原2－DE膠圖譜，1－21數字箭頭所指為匹配的抗原蛋白質點；B：PVDF膜與混合感染兔血清反應的Western blot結果，1－29數字箭頭所指為陽性反應點；C：與混合健康兔血清Western blot結果，虛線圈內為假陽性點。Fig.1 Silver－stained 2－DE gels of S.japonicumsoluble egg antigens（A）and corresponding Western blot results of reactivity with pooled infective rabbit sera（B），and pooled normal rabbit sera（C）.

表1 日本血吸蟲蟲卵抗原蛋白質點質譜鑒定結果Table 1 Identification of proteins in S.japonicumsoluble egg antigens by MALDI－TOF/TOF MS/MS

3 討 論

早在1975年O’Farrell應用雙向電泳成功地分離E.coli蛋白分子，得到類似的蛋白圖譜，受當時技術上限制，不能做膠上蛋白鑒定［7］。20年后生物質譜和生物信息學的發展，才使膠上蛋白質鑒定成為可能，蛋白質組學迅速發展。Jungblut PR等率先將雙向凝膠電泳（2－DE）和 Western blot聯合應用，成功鑒定伯氏疏螺旋體的抗原蛋白質，并于2001年提出免疫蛋白質組學（Immuno－proteomics）概念［8－9］。此后免疫蛋白質組學技術廣泛地應用于細菌、病毒、寄生蟲及腫瘤細胞抗原蛋白質組研究，形成一門新興交叉學科。高分辨率的蛋白質分離方法是蛋白質組學及免疫蛋白質組學的技術關鍵，2－DE是最經典也是目前最常用的蛋白質分離方法。從最初一塊膠分離1 000個蛋白質，發展到現在一塊34cm×24cm大膠可同時分離10 000個蛋白質點［10］。Mathieson W 和 Wolson RA 用2－DE分離曼氏血吸蟲成熟卵可溶性抗原（SEAd），獲得686個蛋白質點［11］。本研究采用13cm（pH 3－10）IPG膠條等電聚焦和15cm×16cm SDS－PAGE電泳分離日本血吸蟲SEA，結果顯示蛋白質點在200個以上，證明有較好的分離效果。將2－DE膠上分離的蛋白質轉印到PVDF膜上，用感染兔血清作Westerrn blot獲得29個特異性陽性反應點，并在2－DE膠圖上找到21個匹配蛋白質點，匹配成功率為72.4%，提示該方案篩選抗原蛋白質是切實可行的。

日本血吸蟲成蟲寄生在宿主腸系膜靜脈內，每天產出大量蟲卵，許多不能排出體外的蟲卵沉集在肝臟、腸道等組織中。成熟蟲卵中的毛蚴不斷向組織釋放蟲卵可溶性抗原，誘發宿主產生一系列免疫反應，形成蟲卵肉芽腫，隨后繼發纖維化。這是血吸蟲病的重要致病機理，蟲卵可溶性抗原是其主要的致病因子。因此，鑒定和分析蟲卵可溶性抗原分子對血吸蟲病免疫治療、免疫診斷以及疫苗研究具有重要意義。Abdel－Hafeez等［12］應用二維高效液相色譜聯合dot－ELISA從SEA和成蟲可溶性抗原（SWAP）中篩選和鑒定具有疫苗研究價值的抗原蛋白，結果分別獲得107個和18個抗原蛋白質，可見SEA中抗原蛋白質數量明顯高于SWAP。本研究用2－DE聯合Western blot方法用感染兔血清抗體從SEA中分離篩選診斷抗原蛋白質，獲得21個匹配蛋白質點，明顯多于Zhong ZR等［13］采用同樣2DE－Western blot從成蟲可溶性抗原（AWA）分離篩選獲得的抗原蛋白質數。雖然2－DE是目前蛋白質組研究中首選的分離方法，在腫瘤、自身免疫性疾病免疫蛋白質組研究中應用較多，但是用于血吸蟲抗原性蛋白質分離存在一些局限性，分離篩選到的抗原蛋白質數較少，這主要與2－DE的第二向SDSPAGE電泳中使蛋白質二硫鍵打開、變性有關，蛋白分子成為線性分子，導致抗原空間構像表位被破壞，大多數的抗原分子被漏檢。

2－DE膠上21個抗原蛋白質點經 MALDITOF/TOF串聯質譜和查庫檢索，61.9%（13/21）獲得匹配蛋白質信息；有8個點NCBI蛋白質數據庫檢索失敗，其中4個點在dbEST數據庫檢索中獲得有意義的匹配，僅4個蛋白質點（19.0%）兩庫檢索均失敗。隨著日本血吸蟲、曼氏血吸蟲基因組計劃的完成，血吸蟲轉錄組、蛋白質組研究不斷深入，血吸蟲生物信息資料不斷得到完善，抗原蛋白質分子的鑒定成功率也將進一步提高。已鑒定的13個抗原蛋白分子中，38.5%（5/13）是70kDa熱休克蛋白（HSP70）。從2－DE膠圖上可見這些蛋白質點分子量基本相同，只是pI有微小變化，推測是蛋白分子修飾不同引起pI差異。SEA中主要蟲卵抗原P40（major egg antigen，SjP40）也是高豐度蛋白質，已有研究證明曼氏血吸蟲、日本血吸蟲的主要蟲卵抗原P40具有較好的抗原性和診斷價值［14－15］。本研究根據質譜鑒定取得的抗原基因信息，分別構建SjP40、SjCHGC06040原核表達質粒，獲得的reSjP40、reSjCHGC06040經Western blot驗證具有較好的抗原性。其中reSjCHGC06040印跡圖中出現的3條帶可能為降解的蛋白引起。已鑒定的其它抗原蛋白質分子有待進一步驗證和開發利用。

2－DE、Western blot和 MALDI－TOF質譜蛋白質鑒定相結合是最經典的免疫蛋白質組學研究技術路線，已廣泛應用于腫瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病研究［16－18］。但是，2－DE 用于血吸蟲抗原性蛋白質分離存在一些局限性，如血吸蟲膜蛋白是理想的抗原分子，但其多為疏水性蛋白，不適合用2－DE進行分離；盡管現有的2－DE靈敏度能達到ng級，但一些低豐度蛋白質仍無法檢測到，因此常見免疫印跡圖上一些陽性反應點，在膠圖上卻找不到匹配的蛋白質點，本研究有8個陽性點未能在膠圖上找到匹配蛋白質點，匹配率為72.4%。高豐度蛋白質大多是一些結構蛋白，無抗原性，往往低豐度蛋白抗原性特別強，可能是理想的診斷抗原；2－DE中第二向電泳中SDS為變性劑，使樣本中所有蛋白質分子的二硫鍵打開成為線性分子，部分抗原決定簇被破壞而失去抗原性，在免疫篩檢時被漏檢。近年來多維高效液相色譜、免疫親和層析、噬菌體展示等蛋白質分離方法陸續應用免疫蛋白質組研究，避免上述2－DE蛋白質分離技術上不足，可以應用于血吸蟲免疫蛋白質組研究。

（對上海中科新生命生物科技有限公司呼建文、丁偉等工作人員在蛋白質組實驗研究中給予技術上幫助表示誠摯的感謝！）

［1］Zhou XN，Bergquist R，Leonardo L，et al.Schistosomiasisjaponicacontrol and research needs［J］.Adv Parasitol，2010，72：145－178.

［2］Berriman M，Haas BJ，LoVerde PT，et al.The genome of the blood flukeSchistosomamansoni［J］.Nature，2009，460（7253）：352－358.

［3］SchistosomajaponicumGenome Sequencing and Functional A－nalysis Consortium.TheSchistosomajaponicumgenome reveals features of host－parasite interplay［J］.Nature，2009，460（7253）：345－351.

［4］Bergquist R，Johansen MV，Utzinger J.Diagnostic dilemmas in helminthology：what tools to use and when？［J］.Trends Parasitol，2009，25（4）：151－156.

［5］Xu J，Peeling RW，Chen JX，et al.Evaluation of immunoassays for the diagnosis ofSchistosomajaponicuminfection using archived sera［J］.PLoS Negl Trop Dis，2011，5（1）：e949.

［6］Ashton PD，Harrop R，Shah B，et al.The schistosome egg：development and secretions［J］.Parasitology，2001，122（Pt 3）：329－338.

［7］O＇Farrell PH.High resolution two－dimensional electrophoresis of proteins［J］.J Biol Chem，1975，250（10）：4007－4021.

［8］Jungblut PR，Grabher G，Stoffler G.Comprehensive detection of immunorelevantBorreliagariniiantigens by two－dimensional electrophoresis［J］.Electrophoresis，1999，20（18）：3611－3622.

［9］Jungblut PR.Proteome analysis of bacterial pathogens［J］.Microbes Infect，2001，3（10）：831－840.

［10］Gorg A，Weiss W，Dunn，MJ.Current two－dimensional electrophoresis technology for proteomics［J］.Proteomics，2004，4（12）：3665－3685.

［11］Mathieson W，Wilson RA.A comparative proteomic study of the undeveloped and developedSchistosomamansoniegg and its contents：the miracidium，hatch fluid and secretions［J］.Int J Parasitol，2010，40（5）：617－628.

［12］Abdel－Hafeez EH，Kikuchi M，Watanabe K，et al.Proteome approach for identification ofSchistosomiasisjaponicavaccine candidate antigen［J］.Parasitol Int，2009，58（1）：36－44.

［13］Zhong ZR，Zhou HB，Li XY，et al.Serological proteome－oriented screening and application of antigens for the diagnosis of Schistosomiasis japonica［J］.Acta Trop，2010，116（1）：1－8.

［14］Abouel－Nour MF，Lotfy M，Attallah AM，et al.Schistosoma mansonimajor egg antigen Smp40：molecular modeling and potential immunoreactivity for anti－pathology vaccine development［J］.Mem Inst Oswaldo Cruz，2006，101（4）：365－372.

［15］Zhou XH，Wu JY，Huang XQ，et al.Identification and characterization ofSchistosomajaponicumSjp40，apotential antigen candidate for the early diagnosis of schistosomiasis［J］.Diagn Microbiol Infect Dis，2010，67（4）：337－345.

［16］Martin K，Ricciardelli C，Hoffmann P，et al.Exploring the immunoproteome for ovarian cancer biomarker discovery［J］.Int J Mol Sci，2011，12（1）：410－428.

［17］Hoppes R，Ekkebus R，Schumacher NM，et al.Technologies for MHC class I immunoproteomics［J］.J Proteomics，2010，73（10）：1945－1953.

［18］Deenadayalan A，Heaslip D，Rajendiran AA，et al.Immunoproteomic identification of human T cell antigens ofMycobacteriumtuberculosisthat differentiate healthy contacts from tuberculosis patients［J］.Mol Cell Proteomics，2010，9（3）：538－549.

Identification of diagnostic antigens fromSchistosomajaponicumeggs with immunoproteomic approach

WANG Yue，YANG Zai－feng，MA An，SHI Xiao－hua，CHEN Zhang－hui，LIU Xiao－long，GAN Xiao－xian

（InstituteofParasiticDiseases，ZhejiangAcademyofMedicalSciences，Hangzhou310013，China）

In order to identify useful candidate antigens for diagnosis of schistosomiasis，two－dimensional electrophoresis（2－DE）technology combined with Western blot and MALDI－TOF/TOF－MS/MS spectrometry were applied to analyse soluble egg antigen（SEA）ofSchistosomajaponicum.After being extracted from eggs，soluble proteins were separated by 2－DE.The gels were used for sliver staining or reacted withS.japonicuminfected rabbit sera to screen antigenic proteins by Western blot.Each antigenic molecule identified by MALDI－TOF/TOF－MS/MS.There were 29spots showed on the PVDF membrane that incubated with infected rabbit sera，while 3non－specific spots were reacted with normal rabbit sera.Twenty－one of these 29positive spots were precisely matched with a homologous 2－DE gel.After identified by MALDI－TOF/TOF－MS/MS technique and searched in NCBI database，13molecules were successfully matched with protein database and 4were EST data，while 4were failed.Of these proteins，SjP40andSjCHGC06040were successfully expressed，and Western blot results showed a specific reaction between the recombinant proteins and infected rabbit sera.Therefore，our data suggests the immunoproteomic approach is a suitable method for screening and identification of diagnostic candidate antigens from eggs ofS.japonicum.

Schistosomajaponicum；soluble egg antigen；immunoproteomics

R383.2

A

1002－2694（2011）10－0861－05

＊浙江省科技廳專項基金（2007F10029）資助

干小仙，Email：xiaoxian＿gan＠hotmail.com

1.浙江省醫學科學院寄生蟲病研究所，杭州 310013；2.浙江省醫學科技教育發展中心，杭州 310006

2011－05－06；

2011－06－19