激光共聚焦顯微重建鮮紅斑痣三維結構的初步研究

田克斌，韓麗林，江銀華，周國瑜

（1.麗水市人民醫院 口腔科，浙江 麗水 323000；2.上海交通大學附屬第九人民醫院 口腔頜面外科，上海 200011）

光動力治療和脈沖激光治療鮮紅斑痣要取得好的效果[1-2]，必須對病灶的結構有清楚的了解，才能對治療參數，比如能量、脈寬等做出相應的選擇，達到理論上實現對血管的選擇性破壞，周圍正常組織得到保護。已有文獻報道組織鑄型、連續切片等技術進行組織的三維結構重建[3-4]，但鮮紅斑痣常常不是由固定知名血管供血，使組織鑄型技術難于實際應用，而連續切片耗時又浪費大量勞力，故也難以廣泛應用。本研究通過厚切片、免疫熒光染色、利用“顯微CT”[5]激光共聚焦顯微鏡觀察，得到鮮紅斑痣三維結構分布圖像。

1 材料和方法

1.1 材料 選取我科臨床、病理診斷為鮮紅斑痣病1例的石蠟包塊作標本，共5個石蠟塊?；颊吣行?，44歲，標本切取部位為面部，未經過治療，皮損形態突出皮膚表面，暗紅色，病灶壓迫可褪色（見圖1）。主要儀器：LSM 510 ZEISS 上海第二醫科大學激光共焦室。主要試劑：鼠抗人anti-cd34（CHEMICON公司），羊抗鼠FITC標記二抗（長島公司）。

圖1 患者標本切取部位（面部）

1.2 方法

1.2.1 載玻片的處理：將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5 min，室溫過夜干燥，裝盒備用。

1.2.2 厚切片的制備：30μm、10μm厚切片，同時制備4μm切片以便于對比。5個石蠟塊的切片數目見表1。

表1 每個石蠟塊切片的詳細數目

1.2.3 染色：分別予HE常規染色、免疫組化染色、免疫熒光染色，以CD34標記血管內皮細胞，以便觀察小血管及與周圍組織對照。陽性對照：已知為CD34陽性的鮮紅斑痣標本；陰性對照：正常皮膚組織；空白對照：以PBS液取代。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡重建：通過激光共聚焦顯微鏡觀察切片，進行三維重建[5]：激光共聚焦顯微鏡能以一定厚度的層距沿軸向對組織進行分層掃描，得到一系列連續的光學切片，經A/D轉換后作為二維數組儲存，逐層掃描得到的二維數組通過計算機進行不同的三維重建算法，作單色圖像處理，組合成真實的三維結構圖形。

2 結果

除了4μm切片都完成全部染色過程外，10μm及30μm的切片很難完成全部染色，因為在免疫熒光染色的過程中，特別是抗原修復時，厚切片容易出現掉片，最后染色結果見表2。

表2 5例標本的免疫熒光染色結果

4μm的15片切片三種染色都能很好的完成；10μm的切片共25片，完成免疫熒光染色后17片脫片，都發生在抗原修復這一步，僅有8片染色成功；30μm切片共50片，它在染色的任何一步都有可能脫片，包括從開始脫蠟至水到后面漂洗過程，完成全部染色過程僅有3片。

4μm和10μm切片經激光共聚焦顯微鏡觀察，可見血管內皮細胞很好地被特異性染色，周圍組織非特異性的熒光很少見，經逐層掃描三維重建后（見圖2），有完整的血管形態及很少量的立體分布信息。因組織量少，包含的血管空間體積少，三維重建后圖像也比較小。

圖2 三維重建后的圖形

30μm切片經激光共聚焦顯微鏡觀察，可見血管內皮細胞沒有很好地被特異性染色，周圍組織非特異性的熒光多見，經逐層掃描三維重建后，雖然也有完整的血管形態，但與周圍組織不能很好地區別，因組織量大，可顯示較多血管立體分布信息。旋轉不同角度可觀察各側面的表面形態，也可不同的斷面觀察組織內部結構，測量血管管徑、斷層面積和體積等形態學參數。通過摸擬熒光處理算法，可以產生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體感，也可通過角度旋轉和位置變化產生三維動畫效果。

3 討論

由于病變血管直徑存在差別，激光儀器治療參數應該是可調節的，但是早期激光儀器的脈沖、脈寬多為固定不變的，使得這類激光儀器很快被可以根據不同病變來調整脈寬大小的激光儀器[6]取代。為了精確地估計目標組織，臨床工作者感到三維結構重建的必要性。因為三維圖形更接近組織的自然狀態，可直觀地觀察結構的分布，便于研究鄰近結構的位置關系。激光共聚焦顯微鏡在三維結構重建[5，7]中，對組織逐點掃描，經空間濾波后，有效抑制干擾熒光，光源為單色性好的激光，基本消色差，成像聚焦后焦深小，可無損傷地對樣品作不同深度的層掃描。沒有組織切片二維圖像的全貌顯示、切片層間配準、切片變形、各個切片間均勻數字化采集等問題[4]。激光共聚焦顯微鏡能以一定厚度的層距沿軸向對組織進行分層掃描，得到一系列連續的光學切片，經A/D轉換后作為二維數組儲存。它在鮮紅斑痣三維結構重建中的成功應用，使其成為一種簡單易行的方法。

厚切片免疫熒光染色過程存在兩個難點：①厚切片的制備：為了更好的重建鮮紅斑痣的三維結構，要求組織有一定的厚度，但受切片技術、免疫熒光染色過程及激光穿透深度的限制。綜合多方面因素考慮后，我們選定30μm厚切片作我們擬重建的組織厚度，相對常規組織切片的厚度4～6μm來說，雖然只差二十幾微米，制作難度有很大差別。與常規組織切片相比，切片時石蠟塊易出現破碎分裂、包埋組織與石蠟分離，很難切出包含完整組織的切片。在我們實驗中，在切片前采用具有一定黏性的紙貼在將要切的組織面，起保護作用防止碎裂，切下組織片后在45 ℃溫水中取下保護紙片，這樣就完成厚切片的制備。②抗原修復的問題：30μm厚切片與10μm厚切片在抗原修復容易發生脫片，因使用的抗體要求用熱修復抗原，當溫度升高后原有的黏接物質被破壞，組織塊與玻片之間分離，在漂洗時就出現脫片。為了防止脫片，進一步的研究是有必要的，其他的染色方法比如使用酶消化修復抗原的抗體，來防止脫片現象。

活體診斷研究的激光共聚焦顯微鏡的應用[8]使臨床醫生對人體鮮紅斑痣三維結構進行觀察成為可能，但是這項技術要在臨床常規應用尚面臨以下問題：①可視深度。②圖像質量需進一步改善，為改善圖像質量就有可能利用激光共聚焦顯微鏡重建的三維圖形。③活體的激光共聚焦顯微鏡無法獲得縱剖面的信息，因活體診斷研究的激光共聚焦顯微鏡的圖像質量需要進一步改善，才有可能為臨床提供有輔助價值的圖像。我們利用組織石蠟切片的方法重建鮮紅斑痣三維結構，可得到比較清晰的圖片。如要達到既能在活體應用又能得到清晰圖片的目標，一種可能的方法就是，先利用組織石蠟切片的方法重建大量鮮紅斑痣標本的三維結構，同時用在活體研究的激光共聚焦顯微鏡記錄粗略圖形，然后把二者聯系起來，建立數據庫。臨床遇到相應病例時就可依據數據庫來選擇治療參數，從而對臨床治療效果和預后判斷產生積極作用。

[1] 周國瑜,張志愿,張陳平,等.口腔頜面部靜脈畸形及血管瘤的激光治療研究[J].中華口腔醫學雜志,2005,40(3):200-202.

[2] 張志愿,周國瑜. 頜面部血管瘤及血管畸形分類選擇綜合治療研究進展[J].北京大學學報:醫學版,2002,34(2):99-102.

[3] Smithies DJ, van Gemert MJ, Hansen MK, et al. Threedimensional reconstruction of port wine stain vascular anatomy from serial histological sections[J].Phys Med Biol,1997,42(9):1843-1847.

[4] 馬慧軍, 趙廣,孟如松,等. 色素痣三維結構的實現與研究[J].CT理論與應用研究,2002,11(1):26-29.

[5] 細胞生物學教研室.細胞生物學技術[M].上海:上海第二醫科大學出版社,2003:24-29.

[6] Astner S, Anderson RR. Treating vascular lesions[J].Dermatol Ther,2005,18(3):267-281.

[7] Zhang WH, Zhu SN, Lu SL, et al. Three-dimensional image of hepatocellular carcinoma under confocal laser scanning microscope[J]. World J Gastroenterol,2000,6(3):344-347.

[8] 田克斌,周國瑜. 激光掃描共焦顯微鏡活體組織診斷技術的應用進展[J].上海口腔醫學,2006,15(1):97-100.