NOS1基因多態性與腔隙性腦梗死相關性研究

高 鵬， 張志茹， 杜丹華， 吳 江

遺傳學研究表明腦卒中的發生具有遺傳易感性。由腦內小血管閉塞所導致的腔隙性腦梗死是腦卒中最常見的一種類型，其與腦內大中血管閉塞所致的動脈粥樣硬化性腦梗死可能存在不同的遺傳學機制。已有研究表明神經元型一氧化氮合酶(nNOS)催化生成的NO是小動脈NO的主要來源，具有抗小動脈硬化的作用［1］。缺乏一氧化氮(NO)會導致腦血管的自動調節功能受損［2，3］，這是腔隙性腦梗死的發病機制之一。但目前國內外尚未見NOS1基因與腔隙性腦梗死關系的文獻報道。本研究將編碼nNOS的NOS1基因作為候選基因，探討其基因多態性與腔隙性腦梗死的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究共納入385例無血緣關系的腔隙性腦梗死患者和313例健康對照人群。病例組來自吉林大學第一醫院神經科2005年～2006年的住院患者，男273例，女112例，平均年齡60.3±11.0歲。由2名神經科醫生根據詳細的神經科檢查、頭部CT或頭部MRI，并依據TOAST分型標準［4］對腔隙性腦梗死患者做出診斷，除外房顫、腫瘤等栓子來源的腦栓塞性疾病;除外肝腎功能不全、血液系統疾病。對照組來自吉林大學第一醫院體檢中心同期門診體檢人群，男186例，女127例，平均年齡59.2±9.2歲。經病史詢問無腦血管病史，部分經頭部CT或MRI證實。所有入組人群均簽署知情同意書，并采集全血用于DNA提取。

1.2 方法 我們選擇了rs9658281(SNP1，MspⅠsite)和rs2682820(SNP2，HaeⅢ site)2個單核苷酸多態性位點，采用限制性酶切片段多態性的方法對SNPs基因型進行分析。應用DNA提取試劑盒(Promega，北京)提取基因組DNA。應用Primer 5.0軟件設計引物，SNP1上游引物:5’-CAACCCTTAGCTTAAATCAG-3’，下游引物5’-GTGCCAGACCTAAGATGC-3’;SNP2 上游引物 5’-CCGAGGGTAACTGGACATTG-3’，下游引物 5’-CAAGGTAGGTGCTATAATCTC-3’，由上海生物工程技術有限公司合成。PCR 反應體系為 25μl，其中雙蒸水 18μl，10mmol Tris-HCl(pH 8.3)，50mmol KCl，1.5mmol MgCl2，4 種 dNTP 各 200μmol，引物各 0.4μmol，Taq DNA 聚合酶(Promega，北京)1.0U，基因組 DNA 30～50ng。PCR反應條件:94℃預變性5min，94℃變性45s，55℃復性 1min，72℃ 延伸 1min，35 個循環，最后72℃延伸10min。酶切體系:PCR產物以限制性內切酶(Promega，北京)于37℃水浴4～6h酶切，經2%瓊脂糖凝膠電泳(90mV)40min，在凝膠成像系統(UVP，美國)下觀察結果。

1.3 統計學分析 應用擬和優度檢驗分析病例組和對照組基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡;采用UNPHASED遺傳學軟件［5］應用cocaphase對SNPs進行連鎖不平衡分析;應用cocaphase對等位基因頻率進行分析;采用SPSS15.0軟件應用卡方檢驗對基因型頻率進行分析;應用t檢驗對近似正態分布的計量資料進行分析。P＜0.05認為有統計學意義。應用Logistic回歸分析調整腔隙性腦梗死傳統危險因素的影響。

2 結果

2.1臨床指標檢測結果 臨床指標分析表明腔隙性腦梗死組高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒的頻率顯著高于對照組(P＜0.01)，腔隙性腦梗死組低密度脂蛋白(LDL-c)水平顯著高于對照組(P＜0.01)，高密度脂蛋白(HDL-c)水平顯著低于對照組(P＜0.01)，兩組總膽固醇和甘油三酯水平無顯著差異(P ＞0.05)。

2.2 Harding-Weinberg平衡分析 擬和優度檢驗表明腔隙性腦梗死組和對照組SNP1和SNP2的基因型均未偏離H-W平衡，說明我們選擇的群體是隨機婚配的群體，可以進行候選基因的關聯分析。

2.3 NOS1基因SNP1和SNP2位點的連鎖不平衡分析 應用UNPHASED軟件對SNP1和SNP2位點進行連鎖不平衡分析顯示，SNP1和SNP2不在同一個連鎖不平衡區(D’=0.14，r2=0.04)。

2.4 腔隙性腦梗死組與對照組 NOS1基因SNP1基因型、等位基因頻率的比較 腔隙性腦梗死組SNP1位點G等位基因頻率顯著高于對照組(χ2=4.135，P=0.042，OR=1.422，95%CI 1.013 ～1.997)，這種差異在女性患者更加明顯(χ2=9.522，P=0.002，OR=2.502，95%CI 1.398 ～4.479)。腔隙性腦梗死組SNP1位點GG基因型頻率明顯高于對照組(χ2=5.862，P=0.015，OR=1.579，95%CI 1.091 ～2.286)，這種差異在女性患者更加明顯(χ2=13.641，P ＜0.0001，OR=3.501，95%CI 1.800 ～6.810)(見表1、表2)。

2.5 腔隙性腦梗死組與對照組 NOS1基因SNP2位點基因型、等位基因頻率的比較 SNP2位點的基因型頻率和等位基因頻率在腔隙性腦梗死組和對照組的分布無顯著性差異(P＞0.05)(具體數據略)。

2.6 腔隙性腦梗死組危險因素的Logistic回歸分析 應用SPSS15.0軟件Logistic回歸分析調整了傳統危險因素的影響，NOS1基因SNP1位點的AA+AG基因型與腔隙性腦梗死仍有顯著性相關(χ2=6.014，P=0.014，OR=0.725，95%CI 0.561 ～0.938)(見表3)。

表1 腔隙性腦梗死組與對照組NOS1基因SNP1位點等位基因頻率比較

表2 腔隙性腦梗死組與對照組NOS1基因SNP1位點基因型頻率比較

表3 NOS1基因SNP1基因型及其它危險因素與腔隙性腦梗死相關性的Logistic回歸分析

3 討論

NOS1 基因定位于染色體的 12q24.2-q24.31［6］，包含29個外顯子，在人類基因組的單體型中以單拷貝形式存在，編碼nNOS。腔隙性腦梗死是由腦內小血管閉塞所致的腦組織缺血、壞死性疾病。而nNOS主要分布于神經元和支配小血管的硝基能纖維，nNOS源性的NO作為神經遞質可引起附近血管平滑肌細胞舒張［7～9］，其生成的NO是小動脈NO的主要來源，具有抗小動脈硬化的作用［1］。因此NOS1基因可能是腔隙性腦梗死潛在的候選基因。研究發現內含子是基因組中的一種重要調控元件，內含子可通過自身的剪接影響基因的表達，也可直接對基因的表達起調控作用［10］。因此我們選擇位于2號內含子上的rs9658281位點(SNP1)及16號內含子上的rs2682820(SNP2)位點為遺傳標記探討NOS1基因與腔隙性腦梗死的關系。

我們的研究發現腔隙性腦梗死組過度傳遞了SNP1位點的G等位基因，提示NOS1基因與腔隙性腦梗死的發生存在關聯。經Logistic回歸分析調整了高血壓、糖尿病、吸煙、血脂異常等傳統危險因素后的P值為0.014，說明NOS1基因多態性與腔隙性腦梗死的發病相關，此前國內外學者均未見報道。

Morishita等［11］研究表明 NOS1 基因5’-UTR 區存在選擇性剪切位點，不同的mRNA剪切變體導致NOS1基因在抑制AS新內膜形成及血管保護中作用的差異。Newton等［12］發現nNOSmRNA的1號變異外顯子和2號外顯子間存在一個89bp的選擇性剪接外顯子，該選擇性剪接外顯子可能是mRNA的翻譯后調控元件，影響基因的轉錄效率，控制這一選擇性剪接的位點可能位于1號外顯子下游和2號外顯子上游27.5kb的區域。我們所檢測的NOS1基因的SNP1位點恰好位于這一區域。由此推測位于2號內含子SNP1位點的連鎖不平衡信號來自這一區域。由于其影響了NOS1基因的轉錄，引起NO生成減少，導致動脈粥樣硬化和腔隙性腦梗死的發生。

我們的研究發現NOS1基因與女性腔隙性腦梗死發生的關系更為密切。含有nNOS的神經元在腦內廣泛存在，它們也分布在控制生殖的腦區。一些學者觀察到雌激素可上調 nNOS的表達［13，14］。而nNOS的表達增加具有抗動脈粥樣硬化的作用。本研究入組的腔隙性腦梗死組女性患者平均年齡為62.4±10.9歲，多為絕經后或圍絕經期女性，普遍存在雌激素缺乏。因此我們推測，由于女性雌激素水平降低，導致nNOS的表達下調。

此外，我們的病例組人群來自于北方漢族人，這一研究結果還需要在不同地域、不同種族的人群中進行大樣本的重復進一步驗證。

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