大鼠局灶性腦缺血預處理后激活轉錄因子4mRNA及其蛋白表達的變化

胡躍強， 唐 農， 董少龍， 畢方方， 祝美珍， 胡玉英， 陳 煒

腦缺血預處理(brain ischemic preconditioning，BIP)是近年發現的重要內源性神經保護機制，可使腦組織對以后較長時間的缺血性損傷產生顯著的耐受。最近有研究發現內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在此環節中發揮了關鍵作用，其中PKR樣內質網激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)介導的未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)信號通路頗為重要，激活轉錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)是 PERK通路中的重要組成物質。

本研究意在通過檢測局灶性BIP后ATF4 mRNA及其蛋白在腦內的表達變化，以進一步研究BIP的神經保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 健康雄性SD大鼠120只，體重250±50g，隨機將大鼠分為3組:假手術組(sham-operation，SO)、大腦中動脈缺血組(middle cerebral artery occlusion，MCAO)、腦缺血預處理組(BIP)。每組按照再缺血后12h、1d、2d、3d 4 個時間點平均分為4個亞組(n=10)分別作如下處理:SO組:以假手術代替預缺血及缺血再灌注;MCAO組:以假手術代替預缺血，其余步驟同BIP組;BIP組:MCAO 10min后抽出栓線，完成預缺血，3d后再次行MCAO 2h，再灌注后 12h、1d、2d、3d 處死大鼠。

1.2 動物模型及標本制備 參照Longa的線栓法進行造模。采用大腦中動脈二次線栓法［1］制備大鼠腦缺血預處理模型，結扎大鼠左頸外動脈遠端和頸總動脈近端，將前端用火焰燒圓的尼龍線從頸總動脈殘端插入，進線約18～20mm，MCAO后10min抽出線栓，完成預缺血。3d后再次行MCAO 2h，再灌注后按規定時間點處死動物取腦。

1.3 缺血半暗帶腦皮質ATF4mRNA表達測定

原位雜交法。按試劑盒說明進行操作。采用HMIAS-2000高清晰彩色病理圖像分析系統測定ATF4 mRNA原位雜交染色的灰度值，平均灰度值在圖像分析中用來表示圖像的透光率，最亮為255級，最黑為0級，平均灰度值越高，說明原位雜交染色越淺，mRNA表達越少。主要就頂葉缺血半暗帶陽性細胞做比較，每張切片測定4個視野(×400)，取平均值。

1.4 缺血半暗帶腦皮質內ATF4蛋白表達測定 大鼠迅速斷頭取腦，冰上分離缺血側頂葉大腦皮質約100mg，冰上研磨組織后加預冷的蛋白裂解液，繼續碾磨至液態，然后4℃、12000r/min離心30min，留上清液，取40μl用BCA法進行蛋白定量測定，所剩上清液按4∶1的比例加變性5×上樣緩沖液，100℃ 水浴10min。取蛋白樣品(40μg)采用10%SDS-PAGE垂直電泳(Bio-Rad，USA)進行分離，然后轉至硝酸纖維素膜(PVDF)上進行免疫反應。5%脫脂奶粉37℃封閉2h，然后依次加入兔抗ATF4抗體(美國ABcam公司，1∶1000)，37℃ 孵育2h，4℃過夜;偶聯有辣根過氧化物(HRP)的羊抗兔IgG(美國Amersham公司，1∶2000)室溫孵育2h，加入LumiGLO(20×)發光劑在X-感光盒內曝光。以上反應均在塑料袋內進行，其間用PBS充分洗滌。將膠片進行掃描或拍照，采用HMIAS-2000高清晰度彩色病理圖文分析系統進行圖像分析，獲取各組Western blot條帶的平均光密度(OD)值，內參為GAPDH，目的蛋白與內參光密度比值即為目的蛋白的相對值。

1.5 統計學處理 SPSS13.0統計軟件處理數據。所有數據用均數±標準差±s)表示，用方差分析進行統計學處理，P＜0.05示差異有顯著性。

2 結果

2.1 ATF4 mRNA表達變化 原位雜交顯示:SO組有少量ATF4 mRNA表達;MCAO組大鼠腦缺血再灌注后12h頂葉皮質缺血半暗帶ATF4 mRNA表達達高峰(P＜0.01)，隨再灌注時間延長其表達逐漸下降，但仍保持較高表達水平(P＜0.01);BIP組缺血后各時間點其表達水平較MCAO組均明顯下降(P ＜0.05)(見表1、圖1)。

2.2 ATF4蛋白表達的變化 Western blot顯示:SO組大鼠有少量ATF4蛋白表達;MCAO組12h頂葉皮質缺血半暗帶ATF4蛋白表達達高峰(P＜0.01)，隨再灌注時間延長其表達逐漸下降，但仍保持較高表達水平(P＜0.01);BIP組缺血各時間點其表達水平較MCAO組均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)(見表2、圖2)。

表1 大鼠頂葉皮質ATF4 mRNA表達的變化±s，灰度值)ATF4 mRNA 表達

表1 大鼠頂葉皮質ATF4 mRNA表達的變化±s，灰度值)ATF4 mRNA 表達

與SO組比較#P＜0.01;與MCAO組同時間點比較*P＜0.05

組別12h 24h 2d 3d SO組MCAO組BIP組186.32 ±12.69123.53 ±9.21#135.67 ±8.74*191.59 ±11.58134.81 ±10.43#148.55 ±8.86*190.80 ±12.76145.48 ±10.15#159.24 ±9.76*188.76 ±12.27153.35 ±11.05#167.89 ±8.78*

表2 大鼠頂葉皮質ATF4蛋白表達的變化±s，OD值)ATF4蛋白表達

表2 大鼠頂葉皮質ATF4蛋白表達的變化±s，OD值)ATF4蛋白表達

與SO 組比較#P ＜0.01;與 MCAO組同時間點比較*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別12h 24h 2d 3d SO組MCAO組BIP組0.823 ±0.0721.624 ±0.129#1.497 ±0.123*0.830 ±0.0751.507 ±0.116#1.389 ±0.105*0.826 ±0.0681.468 ±0.122#1.231 ±0.110＊＊0.834 ±0.0701.325 ±0.113#1.102 ±0.984＊＊

圖1 各組2d時ATF4 mRNA的表達(原位雜交，×400)

圖2 各組1d時ATF4蛋白的表達(Western blot)

3 討論

腦缺血預處理(BIP)是指對腦組織采用機械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，誘導腦組織產生內源性保護機制，使其對以后較長時間的缺血性損傷產生顯著的耐受，這種現象又稱為腦缺血耐受。最近有研究發現［2］BIP可激發適當的內質網應激(ERS)，增強細胞耐受后繼長時間缺血刺激的能力，延緩或減輕I/R造成的組織損傷，并認為ERS可能是腦缺血細胞損傷的關鍵環節。ERS激活未折疊蛋白反應(UPR)是引起凋亡的重要因素，存在顯著UPR的神經元后來出現凋亡，但機制尚未完全闡明。現已知哺乳動物的UPR信號轉導形成了3條互相聯系的通路，其中PERK介導的UPR信號通路頗為重要，因為該基因與GRP78解離后活化而引起的eIF2a磷酸化可直接誘發蛋白質合成抑制［3］，并可誘導ATF4等UPR靶基因在缺血后表達［4］，ATF4能結合ATF/CRE元件序列和氨基酸反應元件的核心序列，調節 CHOP［5］和 ATF3 等的［6］表達，誘導細胞凋亡。有關腦缺血動物模型中ATF4表達的研究國內外甚少報道。

Li［7］等制作大鼠MCAO模型，發現再灌注1h在缺血周邊區可檢出ATF4免疫陽性細胞，再灌注24h達高峰;Rissanen［8］等報道大鼠MCAO模型自發性恢復期間UPR基因的表達情況，該研究將手術組和假手術組動物再分為術后2d、7d、14d、28d等亞組，用原位雜交技術檢測相關基因表達，結果發現手術組和假手術組各亞組大鼠不同腦區ATF4基因表達水平無顯著性差異。上述研究表明ATF4表達僅在缺血再灌注后一定時間范圍內有明顯變化。

本研究發現，大鼠腦缺血120min再灌注12h缺血側頂葉皮質ATF4 mRNA及其蛋白表達即達高峰，隨再灌注時間延長其表達逐漸下降，再灌注72h仍可見其高表達，提示大鼠缺血再灌注損傷誘發的ERS可誘導ATF4的表達，與相關研究報道基本一致［7］。而BIP干預后其表達均有明顯的下降，提示BIP可能通過影響ERS后ATF4的表達而抑制細胞凋亡，從而保護神經細胞。其機制值得進一步研究。

［1］ 郝玉曼，羅祖明，周 東.局灶預缺血誘導腦缺血耐受的動物模型［J］.中風與神經疾病雜志，2003，20(2):129 －130.

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［3］ Pomar N，Berlanga JJ，Campuzano S，et al.Functional characterization of drosophila melanogaster PERK eukaryotic initiation alpha(eIF2alpha)kinase［J］.Eur J Biochem，2003，270(2):293 － 306.

［4］ Morimoto N，Oida Y，Shimazawa M，et al.Involvement of endoplasmic reticulum stress after middle cerebral artery occlusion in mice［J］.Neuroscience，2007，147(4):957 －967.

［5］ Ma Y，Brewer JW，Diehi JA，et al.Two distinct stress signaling pathways converge upon the CHOP promoter during the mammalian unfolded protein response［J］.J Mol Biol，2002，318(5):1351 －1365.

［6］ Jiang HY，Wek SA，MeGrath BC，et al.Activating transcription factor 3 is integral to the eukaryotic initiation factor 2 kinase stress response［J］.Mol Cell Biol，2004，24(3):1365 － 1377.

［7］ Li F，Hayashi T，Jin G，et al.The protective effect of dantrolene on ischemic neuronal cell death is associated with reduced expression of endoplasmic reticulum stress markers［J］.Brain Res，2005，1048(1):59－68.

［8］ Rissanen A，Sivenius J，Jolkkonen J.Prolonged bihemispheric alterations in unfolded protein response related gene expression after experimental stroke［J］.Brain Res，2006，1087(1):60 － 66.