老年大鼠腦出血后海馬齒狀回神經干細胞的增殖與分化

文玉軍， 王登科， 孫 征， 劉海洋， 張蓮香， 王效軍， 秦 毅

腦出血后，出血灶內神經元壞死，出血灶周圍神經細胞大量凋亡，患者出現明顯的神經功能障礙。減少出血灶周圍神經元的凋亡、促進腦內神經干細胞(NSCs)的增殖與分化，對腦出血后患者的神經功能恢復有重要意義。腦出血多發于老年人，因此，本研究觀察老年大鼠腦出血后海馬齒狀回NSCs的增殖與分化，探討腦出血后NSCs的變化規律。

1 材料與方法

1.1 動物分組與模型制備 選用健康老年(18～24月齡，400～550g)SD大鼠［由寧夏醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(寧)20050001］，分組如下:(1)檢測細胞增殖的分組:實驗組選用制備成功的腦出血模型大鼠30只，隨機分為3d、7d、14d、21d、28d 5 個亞組，每亞組 6 只;正常組6只;假手術組6只，術后7d取材。全部按脈沖法標記。(2)檢測細胞分化的分組:正常組、假手術組和實驗組各6只，按累計法標記，術后28d取材。(3)大鼠腦出血模型制備:參照Rosenberg等［1］的方法加以改良，即選用0.5U/μlⅦ型膠原酶和6.25U/μl肝素的混合液0.22μl立體定位注射到大鼠尾狀核建立腦出血模型。假手術組注入等量生理鹽水，正常組大鼠不作任何手術處理。(4)大鼠行為學評分:參照Bederson評分標準［2］對造模后大鼠進行評分，選取1～4分大鼠用于后續實驗。

1.2 BrdU標記增殖細胞 (1)脈沖標記:大鼠處死前24h腹腔注射5mg/ml的BrdU溶液，注射劑量為50mg/kg，間隔4h注射一次，連續注射3次，最后一次注射后24h處死動物。此法用于標記NSCs的增殖變化。(2)累積標記:大鼠腹腔注射5mg/ml的BrdU溶液，注射劑量為50mg/kg，每天一次，連續注射3d，28d后處死大鼠。此法能標記較多的BrdU陽性細胞，用于檢測增殖細胞的分化情況。

1.3 細胞增殖和分化的檢測

1.3.1 BrdU免疫組化染色 經脈沖標記的各組大鼠按時間點常規心內灌注取腦，石蠟包埋，以注射針道為中心連續冠狀切片，片厚7μm，進行免疫組化(SP法)檢測。切片60℃烘烤過夜，常規脫蠟至水，2N HCl(37℃，30min)，3%H2O2(20min)，正常山羊血清封閉(20min，不沖洗)，加入小鼠抗大鼠BrdU抗體(1∶100，4℃過夜)，生物素標記的二抗工作液(37℃，30min)，HRP標記的鏈酶卵白素工作液(37℃，30min)，DAB 顯色，蘇木素復染(20s)，脫水，中性樹膠封片。小鼠抗大鼠BrdU抗體購自北京中杉公司，選擇推薦的乳腺癌標本作陽性對照、PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.2 BrdU/NeuN 和BrdU/GFAP 雙標染色經累計標記的各組大鼠按時間點常規灌注取腦，石蠟包埋，以注射針道為中心連續冠狀切片，片厚7μm，進行免疫組化雙標(SAP/SP法)檢測。BrdU染色除不滴加3%H2O2外，余步驟同前，用堿性磷酸酶復合物代替HRP復合物，滴加NBT/BCIP顯色30min(深藍色)。然后分別行神經元核抗原(NeuN)和膠質纖維酸蛋白(GFAP)染色，DAB顯色。小鼠抗大鼠NeuN抗體和兔抗大鼠GFAP抗體均購自北京中杉公司，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果觀察及數據處理 每只大鼠選3～5張切片，在×400鏡下，每張切片取血腫周圍海馬齒狀回5個不重復視野區，計數BrdU陽性細胞數和BrdU/NeuN或BrdU/GFAP雙標細胞數，利用SPSS12.0統計軟件進行數據統計，實驗數據用均數±標準差±s)表示，進行方差齊性檢驗，方差齊時采用多組間兩兩比較的方差分析q檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗，以P＜0.05作為具有顯著性差異的標準。

2 結果

2.1 大鼠行為學變化和腦出血灶病理學改變

模型組大鼠在術畢清醒后即可觀察到神經功能缺損癥狀，出現腦出血灶對側偏癱癥狀，表現為肢體活動遲緩、進食減少、多數大鼠易倒不能臥立，有拖步行走或旋轉爬行等神經功能缺損表現。術后6h～24h神經功能障礙最為明顯，行為學評分值多為4分。腦組織HE染色顯示患側尾狀核部位神經元大量壞死，形成出血壞死灶，周圍腦組織疏松，細胞腫脹，有炎性細胞浸潤，毛細血管管壁腫脹、破裂。

2.2 老年大鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞數的變化 正常組、假手術組和各出血組老年大鼠的雙側海馬齒狀回均可見BrdU陽性細胞，主要分布在顆粒下區(subgranular zone，SGZ)，細胞形態圓而規則，著色均勻。正常組、假手術組大鼠BrdU陽性細胞少，散在分布，胞核呈圓形淡染，兩組陽性細胞數量無顯著性差異(P＞0.05)。各出血組BrdU陽性細胞明顯增加，與正常組、假手術組相比有顯著性差異(P＜0.01)。出血側SGZ區的BrdU陽性細胞數在術后3d明顯增多，7d達到峰值，14d后BrdU陽性細胞逐漸減少，28d時仍高于正常組和假手術組。出血對側SGZ區也可見BrdU陽性細胞增多，7d時達到峰值，之后逐漸下降，與正常組、假手術組相比，各時段均有顯著性差異(P ＜0.01，P ＜0.05)。出血對側BrdU陽性細胞增加的幅度均較相應出血側低，兩側比較有顯著性差異(P＜0.01)(見表1、見圖1、圖2)。

2.3 免疫組化雙標結果 和脈沖標記相比，累積標記的老年大鼠腦內BrdU陽性細胞明顯增多，在SGZ區、紋狀體、胼胝體均可見BrdU陽性細胞。免疫組化雙標結果顯示，雙標細胞主要見于SGZ周圍，正常老年大鼠腦內可見少量散在雙標細胞，腦出血后雙標細胞數明顯增加(P＜0.01)。BrdU/NeuN雙標細胞胞核大且深染呈圓形，中央呈深藍色BrdU陽性，周邊呈棕色 NeuN陽性(見圖3A)，BrdU/GFAP雙標細胞胞核藍色淺染呈橢圓形，突起呈棕色且長短不一(見圖3B)(見表2)。

表1 老年大鼠腦出血后雙側SGZ區BrdU陽性細胞數變化(個/單位面積，n=6±s)

表1 老年大鼠腦出血后雙側SGZ區BrdU陽性細胞數變化(個/單位面積，n=6±s)

與正常組比較有顯著性差異*P＜0.01;與假手術組比較有顯著性差異△P＜0.01;與假手術組比較有顯著性差異◇P＜0.05;與出血側比較有顯著性差異#P＜0.01

組別 出血側 出血對側正常組假手術組出血3d組出血7d組出血14d組出血21d組出血28d組43.97 ±4.2945.60 ±3.3880.07 ±5.27＊△129.20 ±7.94＊△110.63 ±5.56＊△68.03 ±6.25＊△55.13 ±3.81＊△44.57 ±3.2045.10 ±3.5254.70 ±4.05＊△#97.77 ±5.21＊△#92.00 ±6.11＊△#55.60 ±4.87＊△#47.87 ±4.38＊◇#

表2 老年大鼠腦出血后SGZ區雙標陽性細胞數變化(個/單位面積，n=6)±s)

表2 老年大鼠腦出血后SGZ區雙標陽性細胞數變化(個/單位面積，n=6)±s)

正常組比較有顯著性差異*P＜0.05

BrdU/NeuN BrdU/GFAP正常組出血28d組組別5.77 ±1.1015.77 ±2.05*13.37 ±1.3326.27 ±3.42*

3 討論

在成體中樞神經系統，NSCs主要存在于腦室的室管膜下層(SVZ)和海馬齒狀回的顆粒下層(SGZ)［3］，NSCs具有星形膠質細胞的特性，從神經管至腦發育晚期一直存在，后形成放射狀膠質，是新形成神經元的父本并指導新神經元的遷移［4］。NSCs在自然增殖過程中不斷增殖分化，并遷移到特定區域，以取代老化的神經元，從而保護腦結構和功能的完整性［5］。生理狀態下，成體腦內SVZ和SGZ的NSCs大部分處于靜止期，在運動、學習、環境改變或腦缺血、缺血再灌注、腦梗死等病理性因素刺激下，其增殖分化可明顯增強［6，7］。腦損傷能不同程度地激活腦內NSCs，促進其增殖、分化并遷移至受損部位，參與損傷后神經結構重建和功能恢復［8］。

本研究結果顯示，在正常組、假手術組和各出血組老年大鼠的雙側海馬齒狀回均可見BrdU陽性細胞，主要分布在齒狀回的顆粒層、顆粒下區。正常組和假手術組SGZ的BrdU陽性細胞數量少，細胞呈散在分布，腦出血后SGZ的BrdU陽性細胞數成倍增長，提示腦出血后海馬齒狀回的NSCs可能受到出血等病理因素的刺激，被激活進入分裂狀態引發細胞增殖。觀察發現BrdU陽性細胞在出血后3d即明顯增多，7d時增殖顯著，14d時細胞增殖減緩，28d時陽性細胞明顯減少，增殖能力顯著下降，這可能與隨著出血時間的推移，出血灶不斷機化、縮小、病理刺激減輕等因素有關。出血對側BrdU陽性細胞數較出血側少，但兩側細胞增殖的變化規律是一致的，提示雖然出血對側受到的傷害性刺激相對較弱，但腦出血后機體處于應激狀態，腦微環境的變化可能對雙側腦區NSCs的數量及其增殖活性均有很大影響，另外也可能與機體神經體液調節等作用有關［9，10］。Veizovic 等［11］將標記的 NSCs 植入成年大鼠缺血對側的腦組織，經免疫組化染色發現缺血側腦組織有移植的NSCs出現，結合本研究，提示老年后腦內可能還保留有早期的細胞遷移機制，并可在腦出血等腦損傷后得以活化、啟動。

研究表明海馬與學習、記憶密切相關，在SGZ每天可產生大量的新生神經元［12］，但隨著年齡的增長SGZ的NSCs增殖能力會不斷下降［13］。本研究通過連續3d給大鼠腹腔注射BrdU觀察老年大鼠腦出血后SGZ增殖細胞的分化情況，免疫組化結果顯示，BrdU/NeuN和BrdU/GFAP雙標細胞主要見于SGZ周圍腦區，腦出血后雙標細胞數明顯增加。在腦缺血、腦出血等腦損傷后，腦內會釋放各種刺激因子，如SDF-1因子、凝血酶、促紅細胞生成素等，同時與神經生長有關的生長因子、營養因子和細胞因子等也相繼釋放［14，15］，這些因素可促進 SGZ干細胞的增殖與分化，除了分化產生新生神經元以補充神經元的丟失外，還產生大量的膠質細胞參與病灶的瘢痕修復。與成年相比，老年后腦內微環境的變化使某些營養因子缺乏，有害物質積聚，使得NSCs的增殖分化受到抑制，另外，老年后腦內毛細血管明顯減少，其超微結構及血管形狀發生明顯變化，腦血流量也顯著下降，這些變化不僅可導致原有神經元的退行性變，還直接影響新生神經元的增殖和存活［16］。

研究表明，腦老化后腦內NSCs仍具有一定的增殖活性，并且在某些因素的激發下其增殖活性可以得以增強。深入了解腦老化機制及其對神經再生的影響，在腦出血后促使NSCs更多地分化為神經元，誘導干細胞向損傷區遷移，促進新生神經元的存活，即通過調控內源性NSCs以促進腦出血后缺損的神經功能盡快恢復，將是今后研究的方向。

圖1 正常老年大鼠海馬齒狀回(A)SGZ區BrdU陽性細胞(B)，SP法，A:×100，B:×400

圖2 老年大鼠腦出血后SGZ區BrdU陽性細胞，SP法，×400。A:3d組;B:7d組;C:21d組;D:28d組

圖3 老年大鼠腦出血后SGZ區BrdU/NeuN(A)、BrdU/GFAP(B)雙標細胞，SAP/SP法，×400→標示BrdU陽性細胞，?標示NeuN陽性細胞，?標示BrdU/NeuN雙標細胞

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