脂蛋白脂酶基因和對氧磷酶1基因聯合作用與腦梗死發病的相關性

楊玉梅， 吳 江， 杜丹華， 高 鵬， 劉進香

流行病學及病因學研究表明腦梗死是一種性狀復雜的多基因遺傳病，其發病過程中存在基因-基因和基因-環境的相互作用［1］。動脈粥樣硬化(AS)是腦梗死的主要病因，與脂代謝障礙有關。本研究選取脂代謝環路上的脂蛋白脂酶、對氧磷酶1基因為候選基因，在這2個基因上選擇5個SNPs位點為遺傳標記，應用病例-對照的關聯分析方法，探討這兩個基因間相互作用與腦梗死發病的相關性。為腦梗死的早期預警和針對基因功能的個體化治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇中國北方漢族腦梗死患者和排除腦梗死的健康人為研究對象。其中病例組705人，為2005年10月～2006年6月在吉林大學白求恩第一醫院神經內科住院的腦梗死患者，平均年齡60.9±10.9歲。所有患者均符合1995年中華醫學會第四屆腦血管病會議修訂的各類腦血管疾病診斷要點，由兩名神經科醫生根據詳細的神經科檢查、頭部CT和/或MRI掃描確診為腦梗死，并除外潛在的心源性栓子和周圍血管栓塞性疾病者、大動脈炎、外傷、血液病、藥物、惡性腫瘤、血管畸形或動脈瘤等引起的腦梗死。按TOAST分型標準［2］，分為動脈粥樣硬化性腦梗死組(AS)和腔隙性腦梗死(IS)組。對照組410例，來自吉林大學第一醫院體檢中心同期健康體檢人群，與病例組的年齡、性別相匹配。所有研究對象均有完整的臨床資料，包括性別、年齡、體重指數、既往史、吸煙、飲酒史、家族史、血生化指標(血糖、血脂)、頭部CT或MRI檢查結果，部分患者行腦彩超和頸部血管彩超檢查。所有入組病例均簽屬知情同意書。

1.2 引物設計 根據人類單倍體圖計劃［3］(Hapmap)提供的漢族人數據，選取LPL基因上的2個SNP(SNP1:rs328及SNP2:rs326)及PON1基因上的 3個標簽 SNP(tagSNP)(SNP3:rs2299262、SNP4:rs854552、SNP5:rs662)為遺傳標記，根據引物設計原則設計引物。引物序列如下:SNP1:F:5’-TCACATCCATTTTCTTC，R:5’-CACAGTACAGCTTTAGCACAGAATGCTCACCAGACT-3’;SNP2:F5’-AGGCAGATGCCC TAA TTC C-3’，R:5’-CAC CCT GTG GAA GAA AAT GG-3’;SNP3:F:5’ATCCTCAAACACCTCCGTGA-3’，R:5’-AGGCCCAGAACATTTGGACT-3’;SNP4:F:5’-TGGAGTTCTAAAGACACGTGAGC-3’，R:5’-GGGAGTGATATGATGTGTAGGG-3’;SNP5:F:5’-GCACTTTTATGGCACAAATCATCAC-3’，R:5’-TCCATTAGCAAAATCAAAGCC-3’。

1.3 人外周血白細胞基因組DNA的提取 所有研究對象均于清晨空腹經肘前靜脈取血2ml，肝素抗凝。取300μl用Promega基因組快速提取試劑盒提取基因組DNA。

1.4 基因型檢測 用PCR-RFLP方法進行基因型檢測。(1)PCR反應體系為23μl，其中雙蒸水14.2μl，0.92mmol Tris-HCl(pH8.3)，46mmol KCl，1.5mmol MgCl，4 種 dNTP 各 200μmol，引物各1.5 μmol，Taq DNA 聚合酶 1.0U(Promega，北京)，基因組DNA30～50ng。(2)SNP1位點PCR擴增產物行HinfⅠ內切酶消化;SNP2位點PCR擴增產物行MspⅠ內切酶消化;SNP3位點PCR擴增產物行ECORⅠ內切酶消化;SNP4位點PCR擴增產物行BstN1內切酶消化;SNP5位點PCR擴增產物行DpnⅡ內切酶消化。酶切產物用 2.5%瓊脂糖凝膠電泳(90mmV)50min，在凝膠成像系統(UVP，美國)下觀察結果。

1.5 統計學分析 應用擬和優度檢驗分析病例組和對照組基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg(H-W)平衡;UNPHASED遺傳學軟件應用cocaphase對等位基因頻率進行分析;SPSS15.0軟件包應用卡方檢驗對基因型頻率進行分析。P＜0.05認為差異有顯著性。應用等位基因條件分析(conditioning on allele，COA)的方法分析基因的聯合作用與腦梗死的關系。

2 結果

2.1 臨床資料分析 腦梗死組與對照組間性別、年齡、BMI無明顯差異。動脈粥樣硬化性腦梗死組收縮壓、舒張壓、血糖、甘油三酯與對照組相比差異有顯著性。腔隙性腦梗死組收縮壓、舒張壓、血糖與對照組相比差異有顯著性。

2.2 Hardy-Weinberg平衡分析結果 對研究對象的各SNP位點進行擬和優度檢驗，腦梗死組和對照組基因型分布均未偏離H-W平衡。

2.3 基因型及等位基因頻率比較 腦梗死組與對照組相比各位點基因型頻率差異無顯著性，將腦梗死組按TOAST分型標準分為動脈粥樣硬化性腦梗死組和腔隙性腦梗死組進行亞組分析，仍無顯著性差異(見表1)。SNP1(rs328)G等位基因頻率在動脈粥樣硬化性腦梗死組與對照組相比差異顯著(χ2=4.83，P=0.034，OR=1.47，95%CI=1.03 ～2.13);SNP2(rs326)G等位基因頻率在動脈粥樣硬化性腦梗死組與對照組相比差異顯著(χ2=3.597，P=0.047，OR=1.64，95%CI=1.12 ～1.84)(見表2)。

2.4 LPL基因與PON1基因多態聯合作用與腦梗死的相關性分析 應用等位基因條件分析(conditioning on allele，COA)的方法分析基因的聯合作用與腦梗死的關系。在本研究中，以位于8p22上的陽性位點rs328為條件，來分析位于7q21上的rs2299262和rs854552與rs662等位基因的聯合對腦梗死的發病是否具有作用。結果顯示PON1基因上的rs2299262位點與LPL基因上的rs328聯合作用與腦梗死的發病具有相關性(χ2=6.26，df=2，P=0.043)(見表3)。

表1 各組基因型分布(%)

表2 各組等位基因頻率分布(%)

表3 SNPs聯合作用的條件檢驗結果

3 討論

遺傳學研究表明腦梗死屬于多基因遺傳病。多基因性狀或遺傳病的形成，往往是多個微效基因累加作用的結果，即其中每種基因的作用相對較微弱，數個基因的迭加作用或基因間的相互作用導致了疾病的發生。腦梗死作為復雜性疾病，其發病過程中同樣存在基因-基因和基因-環境的相互作用。已有研究報道基因與基因間的聯合作用與腦梗死的發病存在關聯［4～7］?；蜷g的相互作用主要表現為:(1)一個信息傳導通路上的基因可參與激活或抑制另一條信息傳導通路;(2)兩種不同的信息傳導通路可共同作用于同一基因調控區而協同發揮作用;(3)同一基因可作用于幾條信息傳導通路。

3.1 LPL基因多態性與腦梗死的相關性 由于LPL基因變異可能影響血脂水平和血管功能，從而影響個體對缺血性心、腦血管病的易感性，所以國內外很多學者都進行過LPL基因與腦血管病的相關性研究。我們的研究發現LPL基因rs328、rs326位點G等位基因分布在動脈粥樣硬化性腦梗死組與對照組差異顯著，推測它們可能與動脈粥樣硬化性腦梗死的發病相關［8，9］。

3.2 PON1基因多態性與腦梗死的相關性對氧磷酶1(PON1)基因有多個多態性位點，其突變可造成相應酶活性的改變，在動脈粥樣硬化的形成中起重要作用［10］，故推測其可能影響缺血性腦卒中的發生。我們的研究未發現PON1基因的4個多態性位點與腦梗死的發病相關［11］。

3.3 基因聯合作用與腦梗死發病的相關性本研究所選的5個SNP位點位于兩條不同的染色體上，我們應用等位基因條件分析的方法分析基因的聯合作用與腦梗死的關系。該方法分析的優點是檢驗效力強，可研究不同染色體上的基因位點之間的聯合作用，闡明相互作用的多個位點與腦梗死發病的關聯性。本研究中以位于8p22上的陽性位點rs328為條件，來分析位于7q21上的rs2299262和rs854552與rs662等位基因的聯合對腦梗死的發病是否具有作用。結果顯示PON1基因上的rs2299262位點與LPL基因上的rs328聯合作用與腦梗死的發病具有相關性(χ2=6.26，df=2，P=0.043)。我們考慮如下:(1)我們前面的研究已經發現rs328位點多態性與動脈粥樣硬化性腦梗死的發生相關［8］，推測該多態性促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，斑塊形成及繼發的炎癥反應過程中釋放的細胞因子可能引起PON1基因表達的變化，影響了循環中PON1的活性，促進了腦梗死的發生;(2)PON1基因臨近烯醇式丙酮酸脫氫酶激酶基因，說明PON1基因與糖代謝基因連鎖。而rs328多態性可能與高血糖者發生腦梗死的風險相關，推測rs2299262位點與糖代謝基因的相互作用擴大了rs328多態性的效應。但上述假設尚需進一步驗證。

［1］ Dominiczak AF，McBride MW.Genetic of common polygenic stroke［J］.Nature Genetic，2003，35(2):116 － 117.

［2］ Adams HPJr，Bendixen BH，Kapplle LJ，et al.Classification of subtype of acute ischemic stroke.Defination for use in a multicenter clinical trial［J］.Stroke，1993，24(1):35 －41.

［3］ The International Hap Map Consortium.The International Hap Map Project［J］.Nature，2003，426:789 －796.

［4］ Shen CD，Zhang WL，Sun K，et al.Interaction of genetic risk factors confers higher risk for thrombotic stroke in male Chinese:a multicenter case-control study［J］.Ann Hum Genet，2007，71(5):620 －629.

［5］ Baum L，Ng HK，Wong KS.Associations of apolipoprotein E exon 4 and lipoprotein lipase S447X polymorphisms with acute ischemic stroke and myocardial infarction［J］.Clin Chem Lab Med，2006，44(3):274 －281.

［6］ Szolnoki Z.Evaluation of the interactions of common genetic mutations in stroke［J］.MethodsMol Med，2005，104:241 － 250.

［7］ Pola R，Flex A，Gaetani E，et al.Synergistic effect of-174 G/C polymorphism of the interleukin-6 gene promoter and 469 E/K polymorphism of the intercellular adhesion molecule-1 gene in Italian patients with history of ischemic stroke［J］.Stroke，2003，34(4):881 － 885.

［8］ 楊玉梅，吳 江，杜丹華，等.脂蛋白脂酶Ser447Stop基因多態性與腦梗死的相關性［J］.中華神經科雜志，2009，42(3):175 －177.

［9］ 楊玉梅，吳 江，杜丹華，等.脂蛋白脂酶基因多態性與缺血性腦卒中的相關性研究［J］.中國老年病雜志，2009，29(2):193 －197.

［10］ Mackness MI，Arrol S，Durrington PN.Paraoxonase prevents accumulation of lipoperoxides in low-density lipoprotein［J］.FEBSLett，1991，286:152 －154.

［11］ 楊玉梅，吳 江，杜丹華，等.對氧磷酶1基因多態性與缺血性腦卒中的關聯研究［J］.中風與神經疾病雜志，2008，25(6):648 －650.