eNOS與蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的關系

王燈亮， 康德智， 張元隆， 林章雅， 林元相， 余良宏

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)主要是顱內動脈瘤破裂出血引起，并出現不同程度的腦血管痙攣(cerebral vasospasm CVS)，是引起高致殘率、致死率的主要原因之一。雖然對SAH后血管痙攣的機制研究較多，有學者報道稱多因子機制參與了腦血管痙攣的發生［1］，但目前其具體發生機制仍不十分清楚。

NO是一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)的催化產物，作為一種氣體，NO不容易直接測量，因此，常通過對NOS的研究來間接反應NO生物學作用。根據組織來源可將NOS分為內皮型(eNOS)、神經元型(nNOS)和誘導型(iNOS)。近來有研究顯示eNOS功能紊亂可能參與腦血管痙攣的發展［2］。

本實驗通過兔枕大池二次注血法建立SAH后CVS的模型，運用Western blotting觀察在SAH后不同時間點eNOS表達的變化，旨在探討eNOS與SAH后腦血管痙攣的關系，從而進一步有助于臨床上的診斷和治療。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 研究對象為72只新西蘭大白兔由上海生旺實驗動物養殖有限公司提供許可證號 SCXK(滬)2007-0007，雌雄不限，體重為2.0～2.8kg，自由進食，晝夜節律喂養。主要實驗試劑為eNOS多克隆抗體(武漢伊艾博科技有限公司提供)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組 成年新西蘭大白兔72只，隨機分成以下兩組:(1)對照組(12只)，枕大池注入生理鹽水;(2)SAH組(60只)，按時間隨機分為術后 1d、3d、5d、7d、10d 5 個亞組，每組 12 只，經手術于枕大池注入兔自體耳中央動脈血。

1.2.2 兔SAH模型的制作 采用枕大池二次注血方法建立穩定的蛛網膜下腔出血模型。以鹽酸氯氨酮30mg/kg和氯丙嗪7.5mg/kg肌肉注射進行麻醉。枕部剃毛，俯臥位固定，消毒后于枕部中線作一直切口，長2.5cm，鈍性分離直達寰枕筋膜，2ml注射器針頭經皮穿刺枕大池，此時可見清亮腦脊液流出，按照0.4ml/kg放出腦脊液后，立即從兔耳中央動脈抽取等量非抗凝動脈血緩慢注入枕大池中。首次注血0.4ml/kg，48h后重復上述操作，注入動脈血0.2ml/kg。二次注血24h后為SAH后第1天，依次類推。對照組在放完腦脊液后注入等量生理鹽水，余操作同實驗組。

1.2.3 活體灌注 予鹽酸氯氨酮30mg/kg和氯丙嗪7.5mg/kg肌肉注射對兔進行麻醉。打開胸腔，剝開心包膜，將下腔靜脈和腹主動脈用動脈夾夾閉，剪開右心耳放出血液，再剪開左心室將灌注頭插入主動脈然后用動脈夾固定。行HE染色檢查的兔子先輸入500ml生理鹽水將血管內的血沖洗凈，再注入500ml的多聚甲醛固定液固定。行石蠟包埋后備做檢查。行 Western blotting檢測的兔子灌入500ml 4℃預冷生理鹽水，灌注后取出腦組織和基底動脈，之后將基底動脈分離出來，置于凍存管中，放入液氮灌中速凍后轉入－80℃長期保存。

1.2.4 標本制作及組織學評價 經甲醛固定的腦及血管組織石蠟包埋，在每個基底動脈的近、中、遠段的中點取材，每點連續取1個切片，層厚4μm，切片經蘇木素-伊紅染色后，采用 Leica DM2500顯微鏡以及Image-Pro Plus(Version 5.1)圖像分析軟件測定每個切片中血管標本的橫截面積，計算3張切片平均橫截面積，作為該兔的基底動脈管腔面積。

1.2.5 Western blotting檢測eNOS表達 收集對照組、各實驗組基底動脈標本，使用哺乳動物蛋白抽提試劑(RIPA)進行細胞總蛋白提取，應用BCA法測定蛋白含量。每個樣品槽內10μl樣本進行SDS-PAGE電泳，通過電轉印法將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠上轉移NC膜上，轉印后的NC膜用5%脫脂奶粉室溫輕搖30min后加入一抗(濃度1∶500)，室溫輕搖30min后放于4℃過夜，TBS洗膜后加入濃度為1∶2000的二抗(羊抗兔)，室溫輕搖40min，TBS洗膜，ECL顯色液顯色，拍照。

2 結果

2.1 大體標本觀察 對照組腦干腹側基底動脈周圍無血凝塊，實驗組在1d、3d、5d、7d標本基底動脈周圍可見明顯的凝血塊，隨時間的推移，凝血塊的范圍、大小和顏色呈現減退，至第10天，基底動脈周圍凝血塊已經基本消失(見圖1、圖2)。

2.2 各組基底動脈橫截面積比較 基底動脈行HE染色后，測定每個切片中血管標本的橫截面積，取得各個實驗組和對照組的基底動脈橫截面積。對照組基底動脈橫截面積為584971.4±80780.1 μm2，SAH 第 1 天為 329441.5 ±15907.5μm2;SAH第3天為 404492.3±73172.1μm2;SAH 第 5 天為300619.6 ±26176.2μm2;SAH 第7 天為242604.7 ±45977.1μm2;SAH 第 10 天為 362157.4 ±38480.7。經統計學處理后發現實驗組基底動脈橫截面積總體小于對照組，與對照組比較有差異(P＜0.05)，SAH第3天、第7天和第10天相比，P＜0.05。

2.3 基底動脈組織學變化 在光鏡下，對照組的血管壁無增厚，內皮細胞結構完整，內彈力膜清晰可見，結構完整。SAH模型組可見血管壁增厚，管腔狹窄，內皮細胞變性、腫脹，染色質不均，空泡形成;內彈力膜迂曲皺褶或斷裂，厚薄不均，平滑肌細胞排列紊亂。這些改變在SAH后第1天開始出現，第3天逐漸明顯，第5天和第7天表現最為明顯，第10天上述改變明顯減輕，內彈力膜皺縮基本消失，內皮細胞排列漸趨平整，內皮細胞稍有腫脹，管徑基本恢復正常(見圖3、圖4)。

2.4 各組兔基底動脈eNOS表達情況 Western blotting觀察到eNOS在對照組大量表達，對照組為1.957322 ±0.028485，SAH 第 1 天為 1.833437 ±0.036424;SAH 第 3 天為 1.389229 ±0.072982;SAH第5天為 1.161714±0.030655;SAH 第 7 天為1.239918±0.027786;SAH 第 10 天為 1.434776 ±0.067526。結果顯示實驗組第1天表達開始減少，第5天表達水平明顯減弱，之后表達逐漸增加，與對照組相比均有統計學意義(P＜0.05)(見圖5、圖6)。

圖1 對照組腦干周圍未見蛛網膜下腔出血

圖2 SAH組第5天腦干周圍大量蛛網膜下腔出血

圖3 對照組內皮細胞結構完整，內彈力膜清晰可見，結構完整

圖4 SAH組注血后第5天內皮細胞變性、腫脹，染色質不均空泡形成;內彈力膜迂曲皺褶或斷裂

圖5 各組eNOS表達情況 注:與對照組比較*P＜0.05

圖6 各組eNOS檢測結果

3 討論

蛛網膜下腔出血后約30%～50%患者會出現腦血管痙攣，可導致腦缺血、引起神經功能障礙、甚至死亡［3］。腦血管痙攣呈雙相性，一種為早發性，多見于SAH后0.5h～3d，常于4h內緩解，也稱急性腦血管痙攣;另一種為遲發性腦血管痙攣(DCVS)，發生于出血后4～15d，7～10d為高峰期，2～4w逐漸減少。遲發性腦血管痙攣不同于急性期腦血管痙攣，其一旦發生，難于逆轉，后果往往較嚴重［4］。然而，關于腦血管痙攣的發病機制比較復雜，至今尚未完全闡明。目前普遍認為SAH后CVS是由多因素所致，如高分子溶血產物氧合血紅蛋白(OxyHb)的增多、擴血管物質如NO減少、細胞凋亡、血液高凝狀態、免疫炎癥反應［5］等因素。

本實驗研究結果表明蛛網膜下腔出血后第1天eNOS表達開始減少，第5天減少最嚴重，之后開始慢慢恢復。HE染色提示SAH后第1天開始出現血管壁增厚，管腔狹窄，內皮細胞變性、腫脹，染色質不均，空泡形成;內彈力膜迂曲皺褶或斷裂，厚薄不均，平滑肌細胞排列紊亂;第3天逐漸明顯;第5天和第7天表現最為明顯;第10天上述改變明顯減輕。eNOS的表達與血管壁的病理改變相符。我們認為eNOS與腦血管痙攣可能存在一定的關系，其表達減少可能參與蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的發展。

eNOS是NO/cGMP信號途徑的關鍵酶，通過與內皮細胞鈣離子和鈣調蛋白相偶聯而激活，具有調節血管緊張度和保持內皮細胞功能的作用，可能還有神經保護和抗炎癥作用。血管內皮細胞內eNOS催化產生NO釋放后，能迅速進入鄰近的平滑肌細胞，激活可溶性鳥苷酸環化酶(GC)，GC催化產生環鳥苷酸(cGMP)，cGMP激活細胞內肌質網上鈣泵，使細胞內游離鈣泵入肌質網內，細胞內游離鈣減少，使血管平滑肌處于舒張狀態［6］。同時cGMP可通過抑制蛋白激酶活性，使血管平滑肌舒張。蛛網膜下腔出血后，NO水平下降，則GC活性降低，cGMP生成不足，從而舒張平滑肌能力減弱。eNOS可能通過解偶聯作用導致SAH后繼發腦血管痙攣、微血栓形成，甚至導致神經元細胞的死亡［7］。

eNOS合成的NO作為血管調節因子的同時，還具有維持血管壁幾何形態的作用，對血管性疾病起到預防作用。研究表明，在eNOS基因敲除的大鼠模型中，由于eNOS缺乏可以導致血管壁囊性膨出，提示eNOS合成的NO作為血管舒張因子的同時，還可以起到維持血管壁結構的作用［8］。SAH時由于血管內皮細胞在毒性作用下結構發生破壞，使eNOS活性降低，NO的合成減少，NO含量下降，可造成血管痙攣。有學者指出，eNOS基因多態性可以預測動脈瘤性蛛網膜下腔出血和腦血管痙攣的易感性［9，10］。Pyne-Geithman 等學者研究發現 eNOS 是預測蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的有用指標［11］。許多藥物可能通過調節eNOS的表達而發揮減輕腦血管痙攣的作用:雌二醇可能通過保持eNOS的表達水平而發揮減輕腦血管痙攣的作用［12］;川芎嗪毛冬青(毛披樹)可能通過上調eNOS的表達水平增加NO表達水平從而減輕腦血管痙攣［13］;辛伐他汀通過上調eNOS的磷酸化水平而發揮減輕腦血管痙攣作用［14］。

綜上所述，eNOS是合成NO的關鍵酶，SAH后痙攣的腦血管壁中eNOS減少，從而進一步證明了NO減少在血管痙攣的發展過程中發揮了重要作用。繼續加深對eNOS的研究可能有利于指導臨床腦血管痙攣的防治。

［1］ Guresir E，Raabe A，Jaiimsin A，et al.Histological evidence of delayed ischemic brain tissue damage in the rat double-hemorrhage model［J］.JNeurol Sci，2010，293(1 ～2):18 － 22.

［2］ Osuka K，Watanabe Y，Usuda N，et al.Modification of endothelial nitric oxide synthase through AMPK after experimental subarachnoid hemorrhage［J］.JNeurotrauma，2009，26(7):1157 －1165.

［3］ Pyne-Geithman GJ，Caudell DN，Cooper M，et al.Dopamine D2-receptor-mediated increase in vascular and endothelial NOS activity ameliorates cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in vitro［J］.Neurocrit Care，2009，10(2):225 － 231.

［4］ 陳新軍，袁先厚，江普查，等.蛛網膜下腔出血血漿一氧化氮、一氧化氮合酶含量及其臨床意義［J］.中華醫學雜志，2006，30(6):497－498.

［5］ 張 健，王 中，周 岱，等.NF-κB、ICAM-1在實驗性SAH后基底動脈壁上的表達變化［J］.中風與神經疾病雜志，2009，26(6):684－688.

［6］ Murad F.Nitric oxide and cyclic GMP in cell signaling and drug development［J］.N Engl JMed，2006，355(9):2003 －2011.

［7］ Sabri M，Ai J，Knight B，et al.Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase after experimental subarachnoid hemorrhage［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2011，31(1):190 －199.

［8］ Ozum U，Bolat N，Gul E，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene［G894T］polymorphism as a possible risk factor in aneurysmal subarachnoid hemorrhage［J］.Acta Neurochir(Wien)，2008，150(1):57－62.

［9］ Khurana VG，Sohni YR，Mangrum WI，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms predict susceptibility to aneurysmal subarachnoid hemorrhage and cerebral vasospasm［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2004，24(3):291 －297.

［10］ Starke RM，Kim GH，Komotar RJ，et al.Endothelial nitric oxide synthase gene single-nucleotide polymorphism predicts cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorrhage［J］.JCereb Blood Flow Metab，2008，28(6):1204 －1211.

［11］ Pyne-Geithman GJ，Caudell DN，Prakash P，et al.Glutathione peroxidase and subarachnoid hemorrhage:implications for the role of oxidative stress in cerebral vasospasm ［J］.Neurol Res，2009，31:195－199.

［12］ Lin CL，Shih HC，Dumont AS，et al.The effect of 17beta-estradiol in attenuating experimental subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm［J］.Neurosurg，2006，104(2):298 －304.

［13］ Shao Z，Li J，Zhao Z，et al.Effects of tetramethylpyrazine on nitric oxide/cGMP signaling after cerebral vasospasm in rabbits［J］.Brain Res，2010，1361:67 －75.

［14］ Sugawara T，Ayer R，Jadhav V，et al.Simvastatin attenuation of cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rats via increased phosphorylation of Akt and endothelial nitric oxide synthase［J］.J Neurosci Res，2008，86(16):3635 －3643.