頭部局部亞低溫對實驗性腦出血大鼠腦組織TNF-α、NF-κB 影響的研究

高宏艷， 徐寶林， 吳 江

腦出血(ICH)是嚴重危害人類健康的一類常見疾病。但迄今為止對于ICH仍缺乏很有效的治療方法。作為炎癥反應的重要指標——細胞因子，在ICH病理生理過程中扮演著重要角色。因此，有必要針對抑制ICH炎癥反應這方面進行研究，以指導ICH的臨床治療。亞低溫方法的腦保護作用近些年來逐漸被人們重視起來，作者擬通過研究亞低溫治療對大鼠實驗性ICH急性期腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和核轉錄因子-κB(NF-κB)表達的影響，以繼續探討頭部局部亞低溫治療的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 健康雄性Wistar大鼠36只，月齡3～4個月，體重250～300g。隨機分為常溫組、亞低溫組、假手術組，每組各12只。常溫組和亞低溫組用非肝素化自體血建立ICH模型，亞低溫組在建立模型后立即應用頭部局部亞低溫連續治療48h，常溫組不予以治療，假手術組僅完成同樣的手術過程但不注血，亦不予以治療。

1.2 制備實驗性ICH動物模型 大鼠以10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉生效后，俯臥于立體定位儀上，耳棒固定外耳孔，鼠門齒比前囟及外耳孔連線低2.4mm。無菌操作暴露顱骨，雙氧水顯示前囟，定位前囟后0.2mm，中線旁開4mm，垂直進針5.5mm，為大鼠尾殼核區。經心臟穿刺取非肝素抗凝自體動脈血50μl，5min內緩慢注入大鼠尾殼核區，留針10min后，迅速拔針，無菌骨臘封閉顱骨后縫合皮膚。

1.3 亞低溫治療方法 ICH模型術后，將水循環顱腦制冷儀的冰墊緊貼敷于大鼠的注血側頭部，固定，亞低溫儀溫度設定在15℃ ～18℃，濕毛巾覆蓋于大鼠頭部及冰墊處，以維持大鼠頭部穩定的低溫環境，將溫度傳感器放置于血腫中心部位，監測治療側腦內溫度，溫度控制在32℃ ～34℃。維持低溫治療48h。低溫過程中，注意大鼠的保暖，肛表監測體溫，保持體溫在37℃ ～38℃之間。常溫組和假手術不給予治療，肛表監測體溫，體溫在37℃ ～38℃之間。

1.4 腦組織病理標本采集 各組分別取2只動物，于制作模型48h后，以10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉，生效后，立即取腦，沿進針部位冠狀位切開腦組織，進行大體觀察。各組其余動物于制作模型48h后，以10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉，生效后，用0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛心臟灌流固定，取腦，再用該液浸泡固定4～6h。沿針孔部位前1mm、后2mm冠狀位取材，修塊，酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，連續切片，切片厚度為2μm。分別進行HE染色及免疫組化染色。

1.5 統計學處理方法 在顯微鏡下，每張切片均在血腫周圍以及注血側皮質、胼胝體、脈絡叢的相同部位分別取5個相鄰的200倍視野，以整個細胞或細胞核染成棕黃色作為陽性細胞，計數陽性細胞數，計算出均數和標準差，采用單因素方差分析進行統計學處理。

2 結果

2.1 實驗性ICH動物的行為學變化 大鼠注血后活動減少，反應較術前遲鈍，部分動物可見注血對側肢體活動不靈活，有單方向轉圈現象。

2.2 實驗性ICH動物的腦組織病理改變

2.2.1 大體觀察結果 常溫組:注血側腦組織腫脹，沿進針部位冠狀位切開腦組織，可見血腫呈類圓形，均勻一致，位于基底節區，直徑3mm左右，腦組織周圍水腫，有的可見中線移位。亞低溫組:注血側腦組織腫脹程度較常溫組輕。假手術組:可見腦表面的針孔，腦組織無腫脹。

2.2.2 HE染色結果 常溫組:血腫形成后48h，血腫周圍腦組織結構不清，炎細胞浸潤，腦組織水腫，神經細胞核固縮、濃染，部分神經細胞壞死、消失。膠質細胞腫脹、增生，部分小膠質細胞內存積含鐵血黃素，聚集成片位于血管周圍。周圍小血管可見出血。亞低溫組:腦組織水腫明顯輕于常溫組，膠質細胞反應較輕，周圍小血管出血現象輕于常溫組。假手術組:針道附近有少量炎細胞浸潤，無明顯的組織水腫，無細胞的壞死及膠質細胞增生(見圖1～圖3)。

2.2.3 免疫組織化學染色結果

2.2.3.1 TNF-α 常溫組:TNF-α 大量表達，與假手術組比較，P＜0.01，有統計學意義。陽性細胞主要集中在血腫周圍、注血側皮質、胼胝體、脈絡叢，包括中性粒細胞、淋巴細胞、膠質細胞、神經細胞、血管內皮細胞、室管膜細胞、脈絡叢細胞、胼胝體的成纖維細胞和神經膜細胞。亞低溫組:TNF-α陽性細胞亦增多，但較常溫組明顯減少，P＜0.05，有顯著差異，與假手術組比較，P＜0.01，有統計學意義。陽性細胞主要分布于血腫周圍的中性粒細胞、淋巴細胞、膠質細胞、神經細胞、血管內皮細胞，注血側皮質的膠質細胞、錐體細胞，室管膜細胞，脈絡叢細胞，胼胝體的成纖維細胞和神經膜細胞。假手術組:在針道附近、注血側皮質、胼胝體和脈絡叢可見個別陽性表達的細胞(見表1、圖4～圖6)。

2.2.3.2 NF-κB 常溫組:NF-κB 表達顯著增多，與假手術組比較，P＜0.01，有統計學意義。陽性細胞主要位于血腫周圍、注血側皮質、胼胝體和脈絡叢，以中性粒細胞、淋巴細胞、膠質細胞、神經細胞、血管內皮細胞、室管膜細胞、脈絡叢細胞、胼胝體的成纖維細胞和神經膜細胞為主，陽性表達大部分在細胞核內。亞低溫組:NF-κB在血腫周圍、注血側皮質、胼胝體和脈絡叢也可見明顯的陽性表達，陽性細胞數顯著少于亞低溫組，兩組間比較P＜0.05，具有統計學意義，與假手術組比較，P＜0.01，有顯著差異。假手術組:可見散在NF-κB陽性細胞，個別陽性表達位于核內(見表2、圖7～圖9)。

表1 各組大鼠不同部位TNF-α的表達差異

表2 各組大鼠不同部位NF-κB的表達差異

3 討論

ICH是致死率、致殘率很高的一類疾病，且目前無論是脫水降顱壓、營養神經、調節血壓等內科治療方法，還是開顱手術清除血腫、開瓣減壓、腦室引流等外科方法都不能滿意地降低致死率和致殘率。因此ICH的治療是醫學界長期關注的一個熱點問題。

近些年，人們認識到中樞神經系統亦具有免疫功能，能夠發生免疫反應，并發現ICH也存在著炎癥反應，作為炎癥反應的重要指標——細胞因子，在ICH的病理損傷中扮演著重要角色。

TNF-α是目前研究較多的前炎性細胞因子。TNF-α主要由活化的單核-巨噬細胞產生，在中樞神經系統它可來源于神經細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞、室管膜細胞、血管內皮細胞(VEC)、白細胞等［1］。TNF-α的過量表達對神經系統主要發揮其毒性損害作用。大量臨床及動物實驗研究表明，腦出血后血液、CSF以及血腫周圍TNF-α的表達均顯著增加，其表達程度與血腫大小成正相關，有繼續出血的患者TNF-α表達更高［2］。TNF-α對中樞神經系統的損害作用主要有以下幾個方面:(1)直接損傷作用:對少突膠質細胞具有毒性作用，導致其死亡。(2)參與血腦屏障破壞及腦水腫的形成。(3)參與引起細胞凋亡。(4)參與引起離子失調及神經遞質紊亂［3］。(5)參與引起凝血和抗凝機制平衡失調［4］。(6)促進其他細胞因子及自由基等的釋放，協同加重損傷。近年來，諸多學者對TNF-α的調控機制進行了系列研究，發現TNF-α的表達與NF-κB有著密切的關系。有人研究發現，ICH后1h就有炎癥反應，出血2h后，在局部血管周圍就可以看見NF-κB復合體的活化，出血后8h表達更為廣泛，在出血同側血腫附近的皮質內亦可見NF-κB的表達增加，并且在數天內持續增高，參與造成腦損傷［5］。因此，抑制細胞因子的過量表達，從而減輕大量細胞因子釋放參與造成的血腦屏障破壞、腦水腫、神經元及神經膠質細胞死亡、細胞凋亡等一系列病理變化，是ICH治療方面有待開拓的一個領域［6］。

近來研究表明亞低溫療法可以提高ICH患者的生存率和生存質量。但是，對于亞低溫腦保護機制方面的研究仍很少。本實驗旨在研究頭部局部亞低溫方法對實驗性ICH大鼠腦組織內TNF-α及調控其表達的NF-κB的影響，從而進一步深入探討亞低溫的腦保護作用機制。

采用大鼠腦內緩慢注入非肝素化自體血的方法，建立實驗性ICH動物模型。各組分別于制作模型后48h后取腦連續切片，進行HE染色及用抗TNF-α和抗NF-κB的多克隆抗體進行免疫組化染色(SP法)。從本實驗結果可以看出在大鼠ICH后48h血腫周圍有炎細胞浸潤、膠質細胞增生，并且腦組織內前炎性細胞因子TNF-α以及調控其轉錄和翻譯的NF-κB明顯增多。這表明了在ICH急性期腦組織內炎癥反應的存在。亞低溫治療可以下調NF-κB和TNF-α的表達，并且在亞低溫治療組腦血腫周圍炎細胞減少，膠質細胞增生程度減輕，以及直接病理觀察發現腦組織的腦水腫程度輕于常溫組，以上結果均支持亞低溫方法可以抑制炎癥反應，起到腦保護的作用。而且可以推論，亞低溫方法由于抑制了炎癥反應調控因子NF-κB的表達，從而抑制了炎癥反應。

圖1 常溫組血腫周圍腦組織結構不清，炎細胞浸潤，組織水腫，神經細核固縮，核濃染，周圍小血管出血(HE，100×)

圖2 亞低溫組血腫周圍有少量炎細胞浸潤，腦組織水腫明顯輕于常溫組，膠質細胞反應較輕(HE，100×)

圖3 假手術組針道附近無明顯炎細胞浸潤，無組織水腫(HE，200×)

圖4 常溫組TNF-α在血腫周圍的表達(免疫組化，200×)

圖5 亞低溫組TNF-α在血腫周圍的表達(免疫組化，200×)

圖6 假手術組TNF-α在血腫周圍的表達(免疫組化，200×)

圖7 常溫組NF-κB在皮質的表達(免疫組化，200×)

圖8 亞低溫組NF-κB在皮質的表達(免疫組化，200×)

圖9 假手術組NF-κB在皮質的表達(免疫組化，200×)

［1］ Mayne M，Ni W，Yan HJ，et al.Antisense oligodeoxynucleotide inhibition of tumor necrosis factor-alpha expression is neuroprotective after intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，2001，32:240 － 248.

［2］ Silva Y，Leira R，Tejada J，et al.Molecular signatures of vascular injury are associated with early growth of intracerebral hemorrhage［J］.Stroke，2005，36(1):86 －91.

［3］ Huang R，Sochocka E，Hertz L.Cell culture studies of the role of elevated extracellular glutamate and K+in neuronal cell death during and after anoxia/ischemia［J］.Neurosci Biobehav Rev，1997，21:129－134.

［4］ Szaflarski J，Burtrum D，Silverstein FS.Cerebral hypoxia ischemia stimulates cytokine gene expression in perinatal rats［J］.Stroke，1995，26:1093 －1100.

［5］ Susan L，Hickenbottom，MD，James C，et al.Nuclear factor-κ B and cell death after experimental intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1999，30:2472 －2478.

［6］ Tarkowski E.Intracerebral production of tumor necrosis factor-alpha，a local neuroprotective agent，in Alzheimer disease and vascular dementia［J］.JClin Immunol，1999，19(4):223 －230.