JAK2/STAT3信號轉導通路在大鼠急性脊髓損傷中對細胞凋亡的調控作用

飛 翔， 鎖志剛， 丁惠強， 唐曉杰， 樊 濤

基因調控的啟動需要復雜而周密的信號轉導系統(tǒng)，JAK2/STAT3信號轉導通路是近年來備受關注的一條細胞內重要的信號轉導途徑，該途徑是多種細胞因子和生長因子信號轉導的共同通路，在細胞的增值、分化、凋亡以及免疫調節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用［1～3］。目前對脊髓損傷后信號通路的研究較少，JAK2/STAT3信號轉導通路在ASCI后繼發(fā)脊髓損傷中對細胞凋亡是否起調控作用未得到證實。本實驗應用大鼠急性脊髓損傷模型，檢測 JAK2/STAT3信號轉導通路相關基因JAK2、STAT3的磷酸化水平及細胞凋亡執(zhí)行基因caspase-3在ASCI后的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器 健康成年雄性SD大鼠90只，體重225～275g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供。P-JAK2多克隆抗體(phospho-Try1007+Tyr1008)、P-STAT3多克隆抗體(phospho-Thr705)、Caspase-3多克隆抗體、過氧化物酶標記的鏈霉卵白素染色試劑盒(以上均購自北京博奧森生物技術有限公司)、DAB顯色試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)、AG-490(購自美國Sigma公司)。全自動切片機(德國萊卡公司)、全自動染色儀、自動封片儀(德國MiCROM公司)、BMJ-Ⅲ型包埋機(常州中成電子儀器廠)、顯微照相系統(tǒng)(日本OYLMPUS公司)。

1.2 脊髓損傷動物模型制備 應用Allen’s重物擊落法并加改良制作大鼠急性脊髓損傷模型:大鼠實驗前禁食8h，實驗順序隨機進行。用3%的水合氯醛(27mg/100g)腹腔內注射麻醉，俯臥位固定，無菌操作。取胸背部正中切口，長約2.5cm，逐層切開皮膚及皮下組織，暴露T8-T10椎板，將T9全椎板切除，顯露硬脊膜并使之保持完整，鉗夾固定T8及T10棘突，用質量為10g的克氏針沿帶有刻度的導管從25mm高處垂直自由下落，打擊在直徑4mm，寬2mm的由薄塑料材料制成的半圓片上，致傷后迅速移開打擊物，造成大鼠脊髓不完全損傷，逐層縫合。模型成功的判定標準:打擊后，損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動，麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。對照組只切開T9全椎板，不損傷脊髓。每天切口局部消毒一次，每8h膀胱按摩協(xié)助排尿，直至建立反射性膀胱排空。分籠飼養(yǎng)，自由取食，飼養(yǎng)室溫度保持在25℃左右。

1.3 取材及組織切片制備 在各個時間點逐個對每只大鼠行過量麻醉(注射3%的水合氯醛54mg/100g)，打開胸腔，經(jīng)左心室將管插入主動脈，并用止血鉗固定，切開右心耳，對心臟快速灌注冰生理鹽水，待流出的液體清亮后換用4%多聚甲醛緩沖液固定40min，自背部原切口進入，鈍性剝離，充分暴露脊髓，切取以損傷段為中心長約1cm脊髓，放入4%多聚甲醛緩沖液固定過夜，常規(guī)脫水，石蠟包埋，行冠狀面連續(xù)切片，片厚4μm。取一部分行HE染色，另取一部分做免疫組織化學檢測。

1.4 HE染色及免疫組織化學染色 對3組的每例大鼠脊髓標本進行HE染色，光鏡下觀察兩組在各個時間的脊髓組織形態(tài)結構的改變。

對每例大鼠脊髓標本隨機切取數(shù)張切片，分別進行P-JAK2、P-STAT3及caspase-3免疫組織化學染色。按SP試劑盒說明書操作:烤片、常規(guī)脫蠟至水、高壓修復、3%H2O2去離子水處理、血清封閉、滴加一抗過夜(工作濃度P-JAK2為1:50、P-STAT3為1∶100、Caspase-3為1∶100)，并同時用PBS代替一抗作為陰性對照，次日滴加二抗、S-A/HRP工作液，最后DAB顯色，鏡下控制，蒸餾水終止顯色，以上步驟均用PBS沖洗5min×3次，之后蘇木素輕度復染、沖洗、梯度酒精脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡觀察脊髓組織，以細胞漿棕黃色著色為陽性細胞，每張切片分別于灰質、白質各取3個視野(×400)，采用雙盲法分別計算每個視野的陽性細胞數(shù)，取平均值。

1.5 腹腔給藥 AG490+脊髓損傷組:將AG490(40μg/g)充分溶解到45%二甲基亞楓(DMSO)，脊髓損傷之前20min緩慢注入大鼠腹腔。對照組和脊髓損傷組:只注射等量45%二甲基亞楓。

2 結果

2.1 HE染色結果 對照組各時間脊髓組織的神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質細胞形態(tài)規(guī)則，白質致密(見圖1A)。脊髓損傷組4h毛細血管擴張充血，細胞內水腫，灰質結構破壞，可見少量神經(jīng)細胞死亡，部分神經(jīng)細胞有核固縮表現(xiàn)，12h上述現(xiàn)象逐漸顯著。24h至72h出血范圍擴大，脊髓破壞嚴重，灰質中神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)胞體皺縮和胞核固縮，有凋亡小體形成，白質中可見腫脹的軸突和大量空泡，并有炎性細胞浸潤，72h鄰近階段也有表現(xiàn)(見圖1B)。168h脊髓破壞范圍與72h基本相同，有空洞形成，有很典型的凋亡區(qū)域。AG490+脊髓損傷組各個時間點脊髓組織病理學改變與脊髓損傷組比較無明顯變化。

2.2 P-JAK2、P-STAT3 的表達 P-JAK2、PSTAT3陽性表達的細胞胞漿呈棕黃色顆粒。在對照組各時間點脊髓組織里檢測到少量 P-JAK2、PSTAT3陽性細胞(見圖1C、F)。脊髓損傷組各時間點P-JAK2、P-STAT3陽性表達明顯高于對照組(P＜0.01)，脊髓損傷后4h即在損傷階段及鄰近階段檢測到P-JAK2、P-STAT3陽性表達的細胞。在SCI后12h脊髓損傷組織的背側較腹側損傷嚴重，有少數(shù)變形和壓縮的神經(jīng)細胞存留，P-JAK2和P-STAT3主要表達在這些脊髓前角神經(jīng)細胞，12h達峰值，而后逐漸減少，168h仍有表達，主要在鄰近階段，白質、灰質均檢測到陽性細胞(見圖1D、G)。AG490+脊髓損傷組各個時間點P-JAK2、P-STAT3陽性表達量較脊髓損傷組降低，但峰值不變(P＜0.01)(見表1、表2 及圖1E、H)。

2.3 Caspase-3的表達 Caspase-3表達的陽性細胞胞漿呈棕黃色顆粒。對照組脊髓組織里少見(見圖1I)，脊髓損傷組各時間點陽性細胞數(shù)明顯高于對照組(P＜0.01)，4h即能檢測到大量的陽性細胞，72h達峰值(見圖1J)。AG490+脊髓損傷組Caspase-3的陽性表達量低于脊髓損傷組(P＜0.01)(見表3、圖1K)。

表1 不同大鼠脊髓組織中P-JAK2的表達及陽性細胞數(shù)± s，n=36，個/視野)

表1 不同大鼠脊髓組織中P-JAK2的表達及陽性細胞數(shù)± s，n=36，個/視野)

與假手術比較*P＜0.01;與脊髓損傷組比較#P＜0.01

分組4h 12h 24h 72h 168h對照組脊髓損傷組AG490+脊髓損傷組5.33 ±1.6320.19 ±5.21*14.41 ±4.80*#5.41 ±1.5325.80 ±5.45*15.16 ±4.89*#5.19 ±1.5417.11 ±5.06*12.52 ±3.07*#5.27 ±1.6410.91 ±2.70*8.94 ±2.57*#5.38 ±1.678.83 ±2.42*8.63 ±2.47*#

表2 不同脊髓組織中P-STAT3的表達及陽性細胞數(shù) ± s，n=36，個/視野)

表2 不同脊髓組織中P-STAT3的表達及陽性細胞數(shù) ± s，n=36，個/視野)

與對照組比較*P＜0.01;與脊髓損傷組比較#P＜0.01

分組4h 12h 24h 72h 168h對照組脊髓損傷組AG490+脊髓損傷組5.02 ±1.7312.05 ±2.54*9.88 ±2.69*#5.11 ±1.6328.77 ±4.82*18.69 ±3.10*#5.47 ±1.3125.11 ±4.83*16.50 ±2.40*#5.16 ±1.6618.11 ±4.70*12.91 ±3.16*#5.30 ±1.6715.27 ±4.88*12.72 ±3.15*#

表3 不同脊髓組織中Caspase-3的表達及陽性細胞數(shù)± s，n=36，個/視野)

表3 不同脊髓組織中Caspase-3的表達及陽性細胞數(shù)± s，n=36，個/視野)

與假手術比較*P＜0.01;與脊髓損傷組比較#P＜0.01

分組4h 12h 24h 72h 168h對照組脊髓損傷組AG490+脊髓損傷組3.22 ±1.6213.77 ±4.94*13.38 ±5.22*#3.48 ±1.2626.25 ±6.00*20.25 ±5.22*#3.33 ±1.6041.38 ±6.38*25.72 ±5.97*#3.36 ±1.4953.36 ±4.01*34.52 ±5.07*#3.44 ±1.5024.41 ±4.91*23.30 ±3.73*#

3 討論

3.1 ASCI可異常激活JAK2/STAT3信號轉導通路 本研究基于多數(shù)學者提出的SCI后細胞凋亡調控的時相和空間分布點，選擇4、12、24、72和168h等5 個時間點［4，5］。本實驗結果顯示，在 ASCI后JAK2和STAT3的磷酸化立即發(fā)生，12h達峰值，然后逐漸降低。從變化規(guī)律上看，P-JAK2在SCI后4h表達量迅速上升，12h達峰值，而后下降較快，168h的表達量明顯低于其它的時間點。而P-STAT3則是在SCI后4h緩慢上升至12h的峰值，而后下降緩慢，168h的表達量仍然高于4h(見圖2A、B)，這符合JAK/STAT的代謝機制和快速啟動及瞬間消失的顯著特性［6］。在正常生理狀態(tài)下，JAK2和STAT3會發(fā)生瞬時的磷酸化，這種激活狀態(tài)只持續(xù)數(shù)分鐘至幾小時［7］，對照組里有少量P-JAK2、P-STAT3的陽性表達，說明正常生理狀態(tài)下脊髓組織里 JAK2、STAT3同樣以非磷酸化的狀態(tài)存在為主。而在脊髓損傷組里，P-JAK2、P-STAT3在各個時間點上的陽性表達均高于對照組，證明ASCI后JAK2、STAT3主要以磷酸化的狀態(tài)存在，初步證實JAK2/STAT3信號轉導通路是被異常激活的。

研究表明JAK/STAT信號通路的受體不具備酶的特性，但其胞內段具有酪氨酸蛋白激酶的結合位點，受體與配體結合后，通過與之相聯(lián)系的酪氨酸蛋白激酶的活化，磷酸化各種靶蛋白的酪氨酸殘基來實現(xiàn)信號轉導［8］。這些受體主要有 IL-2、IL-4、IL-4、IL-6、PRL、CSF 等因子［9］。Chen 等［10］報道IL-6 可激活中樞神經(jīng)信號轉導通路JAK/STAT和MAPK，Suzuki等［11］證實 IL-6的下游信號通路 JAK/STAT在大腦局部缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用。在ASCI后也有許多早期炎性細胞因子的表達［12，13］，JAK2/STAT3信號轉導通路是否被這些早期炎性因子激活有待進一步研究證實，這可能是 ASCI后JAK2/STAT3信號轉導通路被異常激活的機制。

3.2 JAK2/STAT3信號轉導通路可調控ASCI后繼發(fā)脊髓損傷中細胞凋亡 脊髓損傷可直接導致神經(jīng)功能喪失，從而引起組織、器官功能障礙。神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞喪失是脊髓損傷后脊髓功能永久性障礙的主要原因。自1996年Li等［14］報道大鼠壓迫性脊髓損傷后白質內出現(xiàn)大量凋亡細胞以來，對ASCI后細胞凋亡的深入研究發(fā)現(xiàn)，許多基因參與了細胞凋亡的調控，其中caspase家族參與凋亡各個時期，是細胞凋亡途徑的核心成分［15］。大量的研究表明，凋亡的發(fā)生是蛋白酶級聯(lián)切割過程，Caspase-3在這一過程中起著核心作用，被稱作死亡蛋白酶［16］，其通過對蛋白激酶、核酸酶及細胞骨架的裂解，產(chǎn)生核皺縮、DNA片段形成等凋亡現(xiàn)象，最終控制凋亡的發(fā)生和發(fā)展。本研究通過免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)ASCI后Caspase-3陽性表達在4h迅速上升，72h達峰值，168h的表達仍高于對照組，這與大部分學者的結果相符［17，18］。HE染色證實損傷最嚴重階段也出現(xiàn)在ASCI后72h，脊髓破壞嚴重，灰質中神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)胞體皺縮和胞核固縮，有凋亡小體形成，Caspase-3的陽性表達高峰與其相同，再次說明caspase-3在ASCI后繼發(fā)損傷中的重要性。

基因調控的啟動需要復雜而周密的信號轉導系統(tǒng)，JAK2/STAT3信號轉導通路是近年來國內外學者研究的熱點，研究主要集中在與免疫系統(tǒng)和腫瘤相關疾病及機制方面。Kong等［19］報道，腦缺血激活JAK/STAT信號轉導通路，磷酸化的STAT3入核發(fā)揮重要功能，調節(jié)大量的基因表達，該信號通路可能直接參與誘導了腦缺血所致的神經(jīng)元凋亡。Wang等［20］研究報道，由JAK2/STAT3信號轉導通路介導，可誘導大量的大腦皮質神經(jīng)元細胞凋亡。還有研究發(fā)現(xiàn)，JAK/STAT3信號轉導通路在許多實體腫瘤和血液腫瘤中被激活，可能與其促進生長和抗凋亡作用有關［21］。STAT是JAK激酶的底物，JAK能使705位酪氨酸殘基磷酸化轉而招募并激活STAT。激活的STAT單體聚合，以二聚體、四聚體等多聚體形式穿越核膜，特異性結合DNA反應元件上，啟動下游目的基因轉錄，使信號從細胞外向細胞內轉導，并實現(xiàn)細胞增值、分化、凋亡以及免疫調節(jié)等過程［22，23］。STAT3是STAT家族中最為活躍的成員［24］，對細胞的生長與凋亡，以及細胞周期的調控都有著重要的影響［25］，是一種具有關鍵作用的的雙功能蛋白，調控大量的下游的靶基因，謝惠芳等［26］在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后，阻斷JAK2/STAT3信號轉導通路后發(fā)現(xiàn)，其能減輕神經(jīng)細胞凋亡，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。本實驗基于此，在建立大鼠脊髓損傷模型之前腹腔內注射AG-490，(AG-490是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種JAK2、JAK3的阻斷劑)可有效阻斷下游STAT3 的活化［27］，結果顯示，P-JAK2、P-STAT3 陽性的表達較脊髓損傷組各個時間的表達降低，同時發(fā)現(xiàn)caspase-3的陽性表達也較脊髓損傷組有明顯降低(見圖2C)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因尚不清楚，但提示JAK2、STAT3是Caspase-3的上游調因子。

總結，本實驗應用大鼠急性脊髓損傷模型，通過分子生物學方法研究發(fā)現(xiàn)，ASCI可異常激活JAK2/STAT3信號轉導通路，同時證實caspase-3是繼發(fā)脊髓損傷中細胞凋亡的重要執(zhí)行因子之一。AG-490可抑制JAK2/STAT3信號轉導通路活化，而且減少了caspase-3的表達，提示該通路是Caspase-3的前提，進一步提示其對神經(jīng)細胞凋亡起著重要調控作用。這為繼發(fā)脊髓損傷的機制提供更多的理論基礎，為研究和設計以信號傳導通路為靶的藥物和治療方法提供新思維。

圖1 3組大鼠脊髓組織HE染色和P－JAK2、P－STAT3、Caspase－3免疫組織化學染色結果

圖2 P-JAK2、P-STAT3、Caspase-3在3組大鼠脊髓組織中各個時間點的表達量及趨勢圖

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