自體間充質干細胞移植異體韌帶重建治療膝交叉韌帶損傷

黃相杰 姜紅江 孟鵬

前交叉韌帶(anterior curiae ligament，ACL)在體育活動中極易損傷，其斷裂后一般不能自發愈合，目前臨床治療的金標準是韌帶重建術，但不管用什么移植材料只是起到模板作用，韌帶移植物都要經歷缺血壞死炎癥期、再血管化過程、成纖維細胞增殖和植入期以及韌帶的塑型改造期大致4個相連續的過程。移植物重塑改造的時間很長，有必要采取措施來加快這一進程。我院自2009年10月至2010年10月間運用自體骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)復合同種異體骨-髕腱-骨移植物重建受損的前交叉韌帶，取得了滿意的臨床療效，現報告如下。

1 臨床資料

本組均為經過MRI檢查、臨床理學檢查及關節鏡檢查證實為前交叉韌帶完全斷裂、同時排除了后交叉韌帶損傷及內側副韌帶完全斷裂的患者，且不伴有同側肢體骨折、骨性關節炎等。2009年9月至2010年10月間，共57位患者按照隨機數字分別納入實驗組和對照組進行手術治療，出院后繼續進行隨訪。

1.1 實驗組 共31例，其中男18例，女13例;年齡19～52歲，中位年齡32.3歲。體重51～87 kg，平均63.4 kg;身高160～187 cm，平均167.9 cm。受傷因素:運動損傷11例，交通事故15例，高處摔傷5例，傷后到手術時間為3 d～22個月，中位病程10.8個月。

1.2 對照組 共26例，其中男15例，女11例;年齡18～55歲，中位年齡33.4歲。體重53～86 kg，平均65.1 kg;身高159～188 cm，平均168.7 cm。受傷原因:運動損傷8例，車輛撞傷13例，高處墜落傷5例，傷后到手術時間為7 d～23個月，中位病程11.2個月。

兩組患者在性別、年齡、身高、體重、致傷原因等一般情況方面均無統計學意義。所有患者均有患膝關節不穩、疼痛、跛行、股四頭肌萎縮致“打軟腿”等癥狀。術前對患膝關節功能分別運用國際膝關節文獻委員會(IKDC)評分及Lysholm評分進行評估，結果顯示兩組患膝關節功能評分均無明顯統計學差異(見表1、2)

2 治療方法

2.1 自體間充質干細胞培養 實驗組無菌條件下在局麻下于兩側髂后上棘抽取骨髓60 ml，在200 g的條件下離心骨髓6 min，取上清液，加入等量 PBS，在1000 g的條件下離心6 min，獲取有核細胞。每平方厘米接種:大約0.8～1.2×106個有核細胞，在37℃、含20%自體PRP、5%CO2濃度下進行細胞培養，每隔3 d換液，細胞長滿后，消化，凍存細胞備用。

2.2 移植物準備 先將同種異體髕骨-髕腱-脛骨(中國人民解放軍骨科研究所組織庫提供)制成骨-髕腱-骨復合體，近端骨塊修剪成直徑9 mm、長2 cm的骨柱，遠端骨修剪成直徑10 mm的全長骨柱。再分別在兩端骨柱上間隔5 mm鉆2個直徑1.5 mm的骨孔，用肌腱線編織縫合髕腱并從骨孔引出。將干細胞懸液與透明質酸鈉(山東博士倫福瑞達制藥有限公司生產)以1:1的濃度混勻備用。將移植物和肌腱線在干細胞懸液中浸泡30 min;按每點0.1 ml多點均勻注入移植物內，再用肌腱線對移植物體部進行編織，最后在移植物表面均勻噴涂干細胞懸液與透明質酸鈉混合物，透明質酸鈉會逐漸固化附著于移植物表面，然后在工作臺上進行預張，備用。

2.3 手術方法 采用硬膜外麻醉或全身麻醉，患者仰臥位，患肢下垂，健側下肢放在支腿架上，患肢大腿根部扎氣囊止血帶。常規消毒鋪單，前外側入路進鏡，關節鏡下常規探查ACL、后交叉韌帶、半月板和軟骨損傷情況。采用前內側入路，處理合并傷，半月板損傷視情況行全切或次全切成型術，軟骨損傷者行軟骨成型術，用籃鉗及刨削器清除原 ACL及滑膜。

首先制備脛骨隧道:將脛骨導向器固定于55°位置上，經髕下內側入口置入關節腔。將瞄準點定于原韌帶脛骨殘端中心位置，使脛骨隧道外口中心距關節面約3 cm。沿導向器鉆入1根2 mm導針，分別用空心鉆頭和套筒鉆作直徑20 mm隧道，保留所獲松質骨供脛骨隧道植骨用。最后修整打磨隧道以適應移植物脛骨附著點的解剖外形。后制備股骨隧道:膝關節屈曲45°，推開后側骨皮質的骨膜，通過脛骨隧道放入股骨導向器。再繼續屈膝至60～90°，檢查脛骨隧道后緣是否有碰撞。沿導向器鉆入1根2 mm導針。用空心鉆頭經導針在股骨鉆孔，直徑20 mm，深1.5 cm。刮匙和傘形刨削器打磨修整隧道，以適應移植物股骨附著解剖外形。保持屈膝60°～90°，從脛骨隧道置入帶槽導針，導針在隧道內的位置偏于脛骨隧道前內側，并鉆穿股骨穿出皮膚。將股骨端肌腱線系于帶槽導針尾孔中，牽拉帶槽導針，從大腿側皮膚拉出，使移植物通過脛骨和股骨隧道。

在關節鏡下用大小合適的生物界面可吸收螺釘擠壓骨塊固定;后在關節屈曲30°～40°位，后壓脛骨結節，拉緊脛骨端骨塊牽引線，再根據患者骨質情況選用1枚與脛骨隧道直徑相同或大1 mm的生物界面螺釘固定脛骨側骨塊。將剩余干細胞懸液與透明質酸鈉混液在關節鏡下注入股骨與脛骨隧道內。再次檢查重建ACL的位置、張力和固定穩定性以及與髁間窩有無撞擊。最后沖洗關節腔，縫合切口。對照組在術中使用透明質酸鈉時不混入干細胞懸液;其余處理均與實驗組相同，以保證兩組數據在邏輯上具有可比性。

2.4 術后處理 術后臥床1 d，靜脈注射抗生素3～5 d。麻醉清醒后即進行股四頭肌等長收縮，踝關節背伸、跖屈及直腿抬高鍛煉。術后第2天開始患膝CMP鍛煉(0°～90°)1 h，2次/d。術后2周拆線，可拄雙拐在支具保護下部分負重。3～4周內膝關節活動控制在10°～90°，5～6周時增至0°～110°，7～8周接近正常，開始過伸及下蹲訓練。術后12周去拐僅在支具保護下行走，強化股四頭肌肌力、關節活動度鍛煉。6個月內支具保護并嚴禁重體力活動。術后12個月內避免患膝劇烈剪切、旋轉運動。

2.5 膝關節功能評估

2.5.1 理學查體標準 膝關節活動度(ROM)測量方法:做滑板運動的動作，即患者靠近滑板墻仰臥，臀部距離滑板墻約一腳的長度，雙下肢分別放于滑板墻上緩慢向下滑動，直至雙下肢各自都不可以繼續下滑。此時，用關節活動度測量儀分別測量健側膝和患側膝的最大下滑角度，計算健側及患側關節活動范圍之差(見表3)。

表1 兩組患者術前及術后各時間點IKDC評分

表2 兩組患者術前及術后各時間點LYSHOLM評分

表3 兩組患者術前及術后健側與患側膝關節活動范圍之差(健側-患側)

2.5.2 患者主觀感覺指標 包括IKDC評分及Lysholm膝關節評分表(包括跛行、負重、絞鎖、關節不穩定疼痛、腫脹、爬樓梯、下蹲，滿分100分)。

2.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料采用了均數±標準差表示，實驗組與對照組內部手術前后的評分運用重復測量方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗;組間采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準設為α=0.05。

3 結果

兩組患者術后均恢復良好，刀口均Ⅰ期愈合，未發生骨折、感染、關節積血、血栓形成等并發癥，且均未出現免疫排斥反應。實驗組31位患者中有3例失訪，對照組26位患者中2位失訪，即共52位患者獲得全程隨訪(現仍在隨訪中)，本文截取每位患者12個月的隨訪情況進行論述。兩組術后各個時間點的IKDC及Lysholm評分、關節活動度均明顯優于術前評測情況(P＜0.01)。在術后3個月、術后6個月及術后12個月時實驗組與對照組患者的IKDC及Lysholm評分均出現較明顯的統計學差異，但是從數據上還顯示這種差異在逐漸縮小而非增加。兩組患者健肢與患肢膝關節活動度之差在術后3個月、術后6個月時顯示出統計學差異，但這種差異在術后12個月消失了。

4 討論

目前ACL重建的手術方法主要有自體或同種異體腱性組織移植以及人工材料等。自體組織移植難以滿足臨床需要，且存在供區并發癥。人工韌帶由于沒有較好地解決疲勞斷裂和強度衰減問題，其應用受限。現認為，理想的韌帶供體移植條件應包括［1］:①容易獲取，有足夠的直徑和長度。②生物學特性與欲替代的韌帶相似。③獲取后不影響正常的組織結構。④能夠保留和提供新的血供。近年來，由于同種異體深低溫凍存移植物重建膝關節 ACL有操作簡便、創傷小、可避免自體肌腱移植術后出現的一系列供區并發癥等優點，故其在臨床上的應用逐漸增多。

盡管自體與同種異體移植物的組織學與生物力學特性各有不同，但目前認為，無論應用哪種移植物其在關節腔內的組織學演化過程相同，都要經過移植物的壞死、再血管化、細胞增殖和膠原纖維重建4個階段，通過爬行替代達到移植物的“復活”［2］。無論是自體還是同種異體的移植物，都只是起到支架作用。雖然同種異體肌腱重建ACL可以得到良好的效果，但有幾個先天矛盾的問題是我們無法逾越的:一般為了去除異體移植物的抗原性和防止感染，現在最好的做法就是深低溫凍干法和鈷60γ射線照射法，上述方法難以避免的會對移植物的生物力學強度產生負面影響，災難性后果就是移植物在術后發生斷裂，文獻報道［3］同種異體肌腱移植術后再斷裂的發生率為6.5% ～15%，明顯高于自體肌腱移植(0～4.8%)。早期生物力學強度不足是同種異體肌腱移植再斷裂的重要原因，同時同種異體移植物血管化和塑形速度較自體移植物慢是再斷裂的另一個重要因素。由于自身組織長入需要一段時間，在這段時間內移植物必須保持一定的張力，才能保證形成的韌帶有力學功能。如何使這個替代過程盡可能在較短時間內完成是手術成敗的關鍵所在。在現階段要求患者延遲負重與參加體育運動的時間成為臨床醫師和患者的無奈之舉。因此，促進同種異體肌腱移植物盡快“浴火重生”，加速實現膠原纖維的重建，成為該領域的研究熱點。

近年來隨著細胞工程和組織化學等技術的發展使得細胞移植成為了可能。骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有很強的自我復制和多向分化潛能的干細胞，研究證實［4］，體內外微環境及各種活性細胞因子的作用下，同樣可以向多個細胞系分化，如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱及其他結締組織。肌腱和韌帶一樣都是特殊形態發生變化的成纖維細胞，該細胞在創傷組織修復過程中起到很大作用。學者North等證實BMSCs可向韌帶樣成纖維細胞分化。Watanabe等將轉基因小鼠的骨髓間充質干細胞移植入野生型小鼠的側交叉韌帶處，注入的細胞數為1×106，28 d后應用原位雜交方法發現，植入的細胞分化為韌帶成纖維細胞。

另外，BMSCs移植可以促進血管新生在諸多研究中已經得到證實，BMSCs移植可以增加缺血臟器的毛細血管密度，改善缺血器官血流量，目前認為其主要機理可能是 :① BMSCs在局部微環境誘導下，向內皮譜系定向分化，自身形成新生血管，增加缺血區血管數量。但是有研究通過用乳酸乙醇酸支架組合成骨樣細胞與BMSC比較成血管能力時發現，雖含小鼠支架材料的血管密度較空白對照組明顯增多，但成骨樣細胞組與BMSCs組分泌的血管內皮生長因子(VEGF)水平相差無幾，血管密度基本一致，且成骨樣細胞是BMSC分化后的細胞，故認為BMSC促進血管再生細胞旁分泌成血管因子是主要作用，與分化的方向相關性不大。② 被移植的BMSCs通過旁分泌(paracrine)的形式分泌血管生成誘導因子和調制內皮細胞遷移的蛋白質，誘導原先存在的血管內皮細胞激活、增殖、遷移、出芽、搭橋，形成新的毛細血管叢，原有的血竇擴張、伸展，血管重塑。其中BMSCs在缺氧環境和二價金屬離子途徑等誘導下產生的VEGF被認為是其促進血管再生的主要細胞因子。

ACL的內部結構與一般的肌腱和韌帶不同，它除了具備致密結締組織的特性外，還有一個重要的特性就是具有一定的纖維軟骨特性。ACL經組織化學甲苯胺藍染色呈現異染陽性已被既往學者所證實，因此其剛性應大于一般的韌帶或肌腱組織。它的這種類軟骨特性在緩沖外力方面發揮著重要作用。當應用異體移植物進行重建時，如果新形成的組織不具備類軟骨的特性，必然會影響膝關節的運動功能。因此，可以把完成膠原纖維重建的移植物是否具有類軟骨特性作為組織成熟的標志之一。在本研究中將具有多向分化能力的BMSCs移植到移植物表面，除了促進成纖維細胞生長、加快移植物塑形改造過程外，考慮應該還有促進移植物體部向具有類軟骨特性方向改造的作用。

另外，本研究采用的是同種異體骨-髕腱-骨作為移植物，所以在愈合過程中并不存在腱-骨愈合的因素。但是我們在手術過程中同樣對止點進行了干細胞移植。其思路在于，雖然本研究采用了帶骨塊移植物固定的金標準-擠壓螺釘(擠壓理論)，這雖然可以提供堅固的孔內擠壓，增加膝關節穩定性和移植物的等長，避免移植物-骨道的運動，但作為異物骨塊，其實這完全就是用植骨治療骨缺損的翻版。研究人員將兔骨髓間充質干細胞與納米羥基磷灰石/殼聚糖復合后植入人為制造的股骨骨缺損中，結果發現僅12周植入體與骨缺損處即骨性愈合，明顯見新生骨生成，骨缺損能夠完全修復，而單純植入殼聚糖的對照組骨缺損處僅部分修復，且部分骨皮質不連續。說明骨髓間充質干細胞移植能夠促進骨缺損的盡快骨性愈合。

在本研究中，我們選擇了廉價易得且容易操控固化時間的透明質酸鈉作為干細胞的載體。一般認為理想的細胞載體應具備以下特點:①良好的生物相容性及降解性。②骨傳導性及誘導性。③滿意的機械強度。④可塑形性。⑤可與其他活性分子復合共同誘導骨發生。⑥支持細胞生長和功能分化的表面化學性質與微結構。透明質酸鈉作為廣泛存在于人體內的生理活性物質，是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基己糖組成雙糖單位聚合而成的一種高分子黏多糖。我們用其作為干細胞的載體，主要是因為本品系生物可降解性高分子聚糖類生物材料制成的高濃度凝膠，無菌、無熱原、無抗原性及致炎性，具有良好的生物相容性及生物學活性，其所形成的高分子網狀結構具有特有的流變學特性。一般6周左右透明質酸鈉即可完全吸收降解，細胞也已實現了增殖和粘附。另外，我們還出于另外一種考慮而采用透明質酸鈉作為BMSCs的載體。經體外誘導分化構建的軟骨細胞移植物一旦脫離嚴格控制的體外培養環境進入關節腔內，能否適應關節腔內的理化成分，國內外仍無文獻報道。但研究同樣發現BMSCs在外源性透明質酸鈉中生長狀況良好，由于關節液中同樣存在透明質酸成分，因此我們用透明質酸鈉作為緩沖，防止細胞過早暴露于關節液中，但在一定程度上又算是對關節液環境的提前適應。

［1］Siebold R，Buelow JU，BosL，et al.Primary ACL reconstruction with fresh-frozen patellar versus achilles tendon allografts.ArchOrthop Trauma Surg，2003，4:180-185.

［2］Lawhorn KW，Howell SM.Scientific justification and technique for anterior cruciate ligament reconstruction using autogenous and allogeneic soft-tissue grafts.Orthop Clin NorthAm，2003，1:19-30.

［3］Chang SK，EgamiDK，ShaiebMD，et al.Anterior cruciate ligament reconstruction:allograft versus autograft.Arthroscopy，2003，19:453-462.

［4］Abdallah BM，Kassem M.Human mesenchymal stem cells:from basic biologytoclinicalapplications. GeneTher，2008，2:109-116.