冬棗多倍體育種研究進展

劉雪紅，崔素芹，劉南南，徐 桂

(1.濱州學院生命科學系，山東 濱州 256603； 2.濱州學院濱州市食品安全重點實驗室，山東 濱州 256603)

隨著對植物多倍體的產生途徑、特征及鑒定方法等方面的深入研究，誘導多倍體育種在育種領域逐漸顯示出日益廣闊的應用前景和發展空間。多倍體果樹一般具有生長健壯、枝粗、葉厚、果大、少籽或無籽、產量高、適應性強和抗逆性強等優點，可用無性繁殖將這些優點穩定地遺傳給后代，而不出現分離。因此，多倍體育種倍受果樹育種研究者的青睞。

冬棗是我國棗品種中鮮食優質品種之一，果皮薄而脆，赭紅色，不裂果，果肉綠白色，細嫩，汁液多，甜味濃，品質極上。研究結果表明，冬棗果肉內除含有一般棗果中的營養物質之外，還富含人體所需的19種氨基酸和維生素A、B、C、D等多種營養物質，冬棗還含有鉀、鈉、鐵、銅等多種微量元素以及抗癌物質環磷酸腺苷、環磷酸鳥苷等。

棗屬植物中存在大量的天然多倍體，如毛葉棗就存在四、六、八倍體類型，贊皇大棗是目前發現的唯一的天然三倍體品種。冬棗的敗育率較高，核內均為單仁，優良冬棗輕敗育品種的敗育率也達20%，因此冬棗多用嫁接技術進行繁殖。近年來，河北農業大學棗研究中心用秋水仙素在田間和組織培養條件下誘導棗樹產生多倍體，已獲得冬棗、辣椒棗等品種的四倍體變異類型。筆者從誘導材料的選擇、誘導方法以及提高誘導效率的途徑等方面，對我國冬棗多倍體育種研究進行了簡要概述。

1 誘導材料的選擇

用于組織培養的外植體材料均可以用來誘導多倍體，其中秋水仙素對于正處于分裂期的細胞誘導成功率較高。因此，大多數學者都采用愈傷組織和叢生芽進行誘導。隨著誘導技術的逐漸成熟，也有用種子、離體組織成功誘導的報道。

1.1 種 子

用種子進行多倍體誘導以前多見于田間試驗，但由于溫度、光照條件的不確定性，對誘導結果有一定的影響。因此，現多用組織培養方法進行多倍體誘導。張蜀敏等用秋水仙素浸種法將未消毒的雪蓮種子分別浸泡在含有0.01%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%秋水仙素的二甲基亞砜（2%）中共處理6 h，然后將處理的種子消毒后，接種到MS基本培養基上。但是試驗結果并不理想，出現較多的嵌合體。

成熟胚的誘導效果不佳，學者們認為剛發育完整的幼胚可能效果會好些。在坐果40天左右，胚發育完整且成活率較高，將該時期的幼胚接種，離體條件下培養。幼胚接種后，主要有3種生活方式：一是形成愈傷組織，坐果后20～40天的幼胚接種后10天左右，子葉、胚軸均能出現愈傷組織，一些黃白色愈傷組織經誘導可以形成小苗，但成苗率很低；二是子葉間出現增生物，坐果后30～55天的幼胚接種后，60%～70%的幼胚子葉間會出現小葉增生的現象，形成蓮座狀，80天左右胚軸伸長，形成一株正常苗；三是直接由胚萌發成苗。相對成熟的胚（坐果55天后）通常是直接萌發成苗，在幼胚長出愈傷組織或新生植株后，可用來做為誘導多倍體的材料。

1.2 愈傷組織

轉基因技術和多倍體誘導技術為棗的育種工作提供了新的平臺，通過愈傷組織途徑誘導多倍體可望實現加倍后的單細胞再分化成苗，從而可避免嵌合體的出現。而愈傷組織細胞分裂能力強，對秋水仙素較敏感，進行處理后比較容易出現多倍體。

1.2.1 冬棗花藥愈傷組織利用花藥或未傳粉子房培養誘導多倍體，再經染色體加倍形成純合二倍體。這是利用現代生物技術進行植物品種選育的新方法。棗的花藥培養開始于20世紀90年代，最早僅在金絲小棗上有報道，但存在愈傷組織誘導率低的問題，而獲得優良的愈傷組織是花藥培養成功的前提。王娜、劉孟軍等以我國最為著名的鮮食品種冬棗花藥為試材，探討了碳源種類、基本培養基和植物生長調節劑對花藥愈傷組織誘導及增殖的影響，為棗的花藥培養及育種工作奠定了基礎。5～6月份選取直徑0.3～0.6 cm且花萼尚未張開的冬棗未成熟花蕾，置于4℃冰箱中預處理

1～3天后，用流水沖洗1～2 小時，轉入0.1% HgCl2溶液中處理8 分鐘，剝取花藥接種到各種處理培養基上。研究結果表明：在MS+麥芽糖20 g/L+TDZ 1.0 mg/L的培養基中，冬棗花藥愈傷組織誘導率最高，達86.8%，黃綠色松散狀的愈傷組織接種到含秋水仙素的培養基可誘導形成多倍體。

1.2.2 葉片愈傷組織寧強等人在組織培養條件下，以冬棗組培苗的葉片為材料，使用TDZ和NAA結合，誘導出生長良好的愈傷組織，為冬棗葉片再生體系的建立，以及進一步的冬棗轉基因和多倍體育種奠定了基礎。

1.3 叢生芽

王娜、劉孟軍等以冬棗和酸棗的組培苗叢芽為材料，研究了秋水仙素誘導染色體倍性變異的最佳濃度與時間組合、多倍體的特征及純化技術。結果表明，最佳組合為50 mg/L秋水仙素處理40天，誘導冬棗和酸棗染色體加倍的頻率分別達到了36.37%和26.67%。嵌合體經3～4次繼代分離得到純化，并對純化后的變異植株進行了增殖和生根，變異株根尖染色體加倍（2n=4X=48），葉片增厚，柵欄組織、海綿組織明顯發達，充分表明獲得的變異株為同源四倍體。蔣洪恩等在田間人工誘導獲得了冬棗、辣椒棗的四倍體和八倍體材料，但未完全純化。

1.4 莖 段

組織培養的莖段比較嫩，易于誘導形成多倍體。王娜、劉孟軍等以二倍體冬棗和酸棗的組培苗莖段為料材，以秋水仙素為誘變劑，在組織培養條件下首次獲得了冬棗和酸棗的純合四倍體植株，結果顯示用0.9%秋水仙素溶液浸泡2天，誘導效果較好。

2 誘導多倍體的方法

2.1 物理誘導方法

1890～1901年，俄國學者格拉希莫夫用人工方法獲得多倍體后，許多科學工作者都開展了人工誘導多倍體方法的研究。多倍體的物理誘導方法有溫度激變、機械創傷、離心力、紫外線、X射線和滲透壓改變等，這些方法的普遍缺陷就是誘導率低。后來由于化學誘導劑的發現，完全取代了物理誘導手段，這些方法也已不再使用。

2.2 化學藥劑誘導

可誘導多倍體的化學藥劑有很多，如秋水仙素、吲哚乙酸、苯及其衍生物、有機砷制劑、磺胺劑及其它植物堿、麻醉劑和生長素等，約有數百種。但使用最多、效果最好的是秋水仙素。利用秋水仙素阻礙紡錘絲的形成，使中期染色體數目加倍。用秋水仙素處理分裂旺盛的植物組織就可以獲得理想的多倍體。萌發的種子和生長點是最好的誘導材料。常用的方法有以下幾種：一是浸漬法，將幼苗、新梢、插條、接穗和種子等實驗材料直接浸泡在秋水仙素溶液中，溶液濃度一般為0.05%～1%，為避免蒸發應加蓋并在黑暗條件下處理，發芽的種子一般處理數小時至3天，插條、接穗、幼苗一般處理幾天；二是涂抹法，把秋水仙素按一定濃度配成乳劑或混于羊毛脂膏內，涂抹在幼苗或枝條的頂端及花芽上；三是液滴法，常用秋水仙素的濃度為0.1%～1.0%，用脫脂棉包裹幼芽或花芽，每天滴一至數次，反復處理幾日，使溶液透過表皮滲入組織內而起作用，寧強、劉孟軍等用液滴法處理人為條件下在冬棗枝條上形成的愈傷組織，當秋水仙素的濃度為0.05%，處理18小時其誘變效率最高；四是注射法，用注射器將秋水仙素藥液注入植株的芽或生長點，溶液濃度一般為0.4%左右；五是藥劑培養基法，在材料的離體培養基中加入一定濃度的秋水仙素溶液，將外植體共培養一段時間后轉到不含有秋水仙素的新鮮培養基中培養。

秋水仙素的處理濃度和時間因處理對象的不同而異，一般在0.01%～1.0%以內都是有效的，在對某一植物作初次誘導試驗時，一般采用低濃度長期處理的方法。

蔣洪恩、劉孟軍以二倍體冬棗、梨棗和辣椒棗的新生棗頭為試材，經秋水仙素溶液誘變處理，首次獲得了梨棗、冬棗和辣椒棗的八倍體材料，結果表明誘導不同品種的多倍體其最佳處理時間和濃度組合不同。梨棗的最佳處理組合為0.15%的秋水仙素處理18 小時，誘變率為50%；辣椒棗的最佳處理組合為0.1%的秋水仙素處理30 小時，誘變率為43.3%；冬棗的最佳處理組合為0.15%的秋水仙素處理18 小時，誘變率也為43.3%。

寧強、劉孟軍等以二倍體冬棗和梨棗的愈傷組織為材料，用秋水仙素對愈傷組織進行誘變，首次獲得了四倍體植株，結果表明，不同品種、不同秋水仙素濃度和處理時間對愈傷組織的誘變效果不同。對梨棗而言，0.05%的秋水仙素濃度處理24小時效果最好，愈傷組織變異率達到13.3%；而對冬棗來說，0.05%的秋水仙素濃度處理8 小時效果最好，愈傷組織變異率達到6.7%。

2.3 利用組織培養技術誘導多倍體

利用組織培養誘導多倍體的方法是最近十幾年科研工作者采用較多的方法，該方法誘導率高，并可以克服同源多倍體育性低的缺陷，有較大的發展潛力。組織培養中使細胞染色體加倍的因素很多。據報道，不同培養基的物理狀態對二倍體和多倍體的選擇壓力不同。培養基中加入適當濃度2,4-D及其它激素也可增加培養物上多倍體細胞的含量。但實際應用中最多的仍是秋水仙素。可將秋水仙素加入培養基中進行誘導培養，也可先用秋水仙素溶液浸泡愈傷組織，再直接接種到培養基上進行培養。

不同材料、不同處理方法對組培苗的誘變效果不同，其中叢芽的混培率最高。嚴仁玲等在組織培養條件下成功地將二倍體金絲小棗誘導出了四倍體植株。王娜、劉孟軍等用冬棗和酸棗的二倍體組培苗為材料，以秋水仙素為誘變劑在組織培養條件下首次獲得了酸棗和冬棗的純合四倍體植株。酸棗和冬棗叢芽的最佳處理時間和濃度組合均為含50 mg/L秋水仙素的MS培養基混培4天，誘變頻率分別為36.67%和26.67%。酸棗莖段最低處理時間和濃度組合為0.4%的秋水仙素溶液浸泡處理4天，誘變頻率為23.33%；冬棗莖段最佳處理時間和濃度組合為0.4%秋水仙素浸泡處理2天，誘變頻率為16.67%。相比之下，混培法更適合于叢芽誘變，浸泡法更適合于莖段誘變。酸棗的誘變頻率明顯高于冬棗。

不同材料、不同處理時間對愈傷組織的誘變效果不同。寧強等以冬棗和辣椒棗葉片為試材，在離體條件下誘導愈傷組織的形成，并利用秋水仙素對愈傷組織進行浸泡法和根培法處理。對于冬棗而言，浸泡葉片愈傷組織，秋水仙素溶液濃度0.01%處理4天，變異率最高為13.3%；混培法中，對葉片進行10天的預培養，秋水仙素濃度0.004%處理15天的變異率最高達6.7%。

3 提高組培苗誘變效率的途徑

王娜、劉孟軍等以冬棗組培苗叢芽和莖段為材料，以秋水仙素為誘變劑，研究了預培養、暗培養、二甲基亞砜和活性炭對誘導多倍體均有一定的影響作用。實驗表明：對組培苗莖段進行4天預培養時，冬棗變異率最高，可達10%；對組培苗叢芽進行15天暗培養的處理，致死率最低、變異率最高，冬棗變異率為26.67%。

二甲基亞砜是一種誘變輔助劑，能夠幫助處理材料吸收秋水仙素，但當二甲基亞砜的濃度偏高時會使材料致死率升高。活性炭可通過降低處理材料的褐化來提高誘變效率。因此，離體條件下提高誘變率的關鍵因素之一是抓住細胞旺盛分裂的時機進行誘變，使盡可能多的細胞加倍，以減少嵌合體出現的幾率，或縮短嵌合體分離的過程。另一關鍵因素是降低處理材料的死亡率，使加倍的細胞盡可能多的存活下來。

4 冬棗多倍體育種現狀

4.1 冬棗多倍體育種中存在的問題

冬棗棗胚敗育率高，一般不是直接采用種子作為誘導材料，而是在組織培養條件下，選取莖組培苗莖尖、莖段、叢生芽為試材，通過誘導愈傷組織或直接進行多倍體誘導。如以愈傷組織作為誘導材料，則愈傷組織分化率低，不易長成幼苗。而且在多倍體誘導過程中發生加倍效應的往往是部分細胞，嵌合體的產生是難以避免的，能否對嵌合體進行及時有效地分離成為獲得同源多倍體的關鍵因素。

4.2 多倍體中嵌合體與純合體的比較

在誘導植物多倍體時，嵌合體是一種較為常見的現象。在嵌合體細胞的競爭過程中，細胞倍性的發展方向具有不確定性，若二倍體在嵌合體中占優勢，多倍體就會在競爭中逐漸消失而使材料恢復為二倍體；相反若四倍體細胞占優勢，則材料可以形成穩定的四倍體。目前解決嵌合體最好的方法是選擇單細胞或單細胞起源的誘導材料，如葉片外植體愈傷組織，原生質體等。

4.3 田間誘導與離體誘導

4.3.1 從誘導方法上來看田間誘變常采用秋水仙素涂抹法，使誘變劑直接與生長點接觸促使其發生變異，該方法直接作用于生長點，易產生變異；但也加重了對生長點的傷害，不適合于像冬棗這些對秋水仙素忍耐力較弱的材料。材料離體誘導一般有兩種方法：秋水仙素溶液浸泡法及秋水仙素培養基混培法。混培法是比較適合于離體材料誘變的一種低濃度長時間的處理方法，且混培法比田間誘導簡單得多，不需要逐株進行處理，只需將秋水仙素加入到培養基中，同時可處理大量材料，節省了人力物力。

4.3.2 從嵌合體分離來看蔣洪恩認為，田間條件下可采用修剪法對嵌合體進行純化，但這種方法操作繁瑣，而且并不能得到純合體植株。而在離體條件下，嵌合體的分離可及時進行，且操作簡單便捷。

4.3.3 從對變異株的鑒定來看 無論是田間誘變還是離體誘變，都可以通過形態觀察來對誘變材料進行初期鑒定。離體條件下，還可在不影響組培苗正常生長的情況下，通過檢測根尖或葉片的染色體倍性來確定材料的變異情況。

因此，利用組織培養可以同時誘導大量材料，而且培養條件容易控制，重復性好，易于進行嵌合體的分離及多倍體的鑒定，得到的四倍體植株當年就可大量擴增。這預示著利用組織培養離體誘導多倍體，有可能廣泛適用于其它建立高效組織培養再生體系的各種作物，從而在染色體工程中具有廣闊的應用前景。

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