Allo-PBSCT患者CD4+CD25+調節性T細胞的體外研究

翟海龍，賴永榕

(1黃石理工學院醫學院，湖北 黃石 435003;2廣西醫科大學第一附屬醫院)

異基因外周血干細胞移植(Allo-PBSCT)是近年來臨床上廣泛采用的一種先進的造血干細胞移植技術，對白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤等惡性血液病有很好的治療效果;然而，移植物抗宿主病(GVHD)作為Allo-PBSCT一種常見的嚴重的并發癥長期困擾著臨床。動物實驗表明，Allo-PBSCT后 CD4+CD25+Tregs可抑制激活的T細胞而預防GVHD［1］。為此，本研究對Allo-PBSCT后CD4+CD25+Tregs體外是否有無反應性及其抑制功能進行了研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2004年10月～2006年5月在廣西醫科大學第一附屬醫院血液科行Allo-PBSCT的血液惡性腫瘤患者36例(Allo-PBSCT組)，男27例、女9例，年齡9～56歲、中位年齡34歲;其中，急性髓細胞白血病7例，急性淋巴細胞白血病9例，慢性粒細胞白血病14例，非霍奇金淋巴瘤1例，多發性骨髓瘤1例，骨髓增生異常綜合征4例。36例中，GVHD患者16例(GVHD組)，無GVHD患者20例(無GVHD組)。供者均為同胞兄弟姐妹，HLA配型6個位點全相合44例，1個位點不相合3例。對照組募集健康志愿者7例，男5例、女2例，年齡24～34歲、中位年齡28歲。在移植后+30 d采集上述Allo-PBSCT組和對照組EDTA抗凝外周血20 ml。

1.2 方法

1.2.1 主要實驗試劑、儀器 熒光單抗試劑:美國BD公司產;CD4+CD25+Tregs分離試劑盒:德國Miltenyi生物技術公司產;淋巴細胞分離液:上海檢測試劑公司產;IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β、IFN-γ ELISA檢測試劑盒:晶美生物工程有限公司產。EPICS-XL流式細胞儀:美國Beckman Coulter公司產;Midi和Mini磁性細胞分離柱、磁性細胞分離器:均為德國Miltenyi生物技術公司產;精華牌TGL-16G型高速離心機:太倉市醫療機械廠產。MK3型酶標儀:美國Thermo電子公司產。

1.2.2 CD4+CD25+Tregs增殖和混合淋巴細胞反應 ①分離外周血單個核細胞(PBMCs)。②分離CD4+CD25+Tregs。③CD4+CD25+Tregs和 CD4+CD25-T細胞的記數和純度檢測:CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細胞記數前，可得到(1.0～1.1)×105個 CD4+CD25+Tregs和(1.2 ～1.5)×105個CD4+CD25-T細胞。取CD4+CD25+Tregs細胞液和CD4+CD25-T細胞各100 μl行流式細胞術檢測，檢測指標為CD4和CD25。如CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細胞的純度均大于80%，即可從事下面的實驗。④離體CD4+CD25+Tregs的增殖和混合淋巴細胞反應:a.細胞培養:分別取2×104CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細胞以及2×104個CD4+CD25+Tregs與2×104個CD4+CD25-T細胞混合3組細胞構成1個大組，建立2個大組;將這2個大組加入到96孔培養板的6個孔中，再加入RPMI1640細胞培養液 200 μl，10% 小牛血清，10 μg/ml可溶性抗 CD3-mAbs 試劑 2 μl，5 μg/ml抗CD28-mAbs試劑4 μl，置于37℃培養箱中培養72 h。b.檢測細胞數量:取1個大組的3個孔每孔加入10 μl CCK-8溶液，將培養板置于37℃培養箱孵育1 h，取出后置于酶標儀上450 nm波長檢測OD450值。c.顯微攝影(×100)。

1.2.3 CD4+CD25+Tregs 離體分泌和抑制 CD4+CD25-T細胞分泌實驗 細胞培養48 h后從培養箱中取出培養板，將3個孔的細胞液移至0.5 μl離心管中用高速離心機以5000 r/min離心10 min。吸取上清液于0.5 ml的離心管中，編號后將離心管置于-70℃的低溫冰箱中，待積累到47例份后用雙抗體夾心ELISA 法測其 IL-10、TGF-β、IFN-γ細胞因子的濃度。

1.3 統計學方法 運用SPSS11.5統計軟件，計量資料采用表示，多個樣本均數比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD4+CD25+Tregs和 CD4+CD25-T細胞的純度 本實驗中CD4+CD25+Tregs和CD4+CD25-T細胞的純度均大于80%。

2.2 CD4+CD25+Tregs的無反應和抑制實驗 有無GVHD患者和對照組CD4+CD25+Tregs OD450值極低，均與本組CD4+CD25-T細胞有統計學差異(P＜0.01)。表明有無 GVHD患者 CD4+CD25+Tregs在抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的共同刺激下不增殖，表現出與正常對照組人群CD4+CD25+Tregs類似的無反應性特征。同樣，有無GVHD患者混合細胞也有類似特征。見表1。

表1 CD4+CD25+Tregs的無反應和抑制實驗(OD450值，)

表1 CD4+CD25+Tregs的無反應和抑制實驗(OD450值，)

注:與本組CD4+CD25-T細胞比較，*P＜0.01

組別 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T細胞 混合細胞對照組 70.052 ±0.008* 1.780 ±0.5370.529 ±0.074*GVHD 組 160.048 ±0.009* 1.732 ±0.7410.607 ±0.058*無 GVHD 組 200.049 ±0.011* 1.695 ±0.6280.572 ±0.063*

2.3 CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制 CD4+CD25-T細胞分泌實驗 有無GVHD患者離體CD4+CD25+Tregs在抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的共同刺激下分泌的 IL-10、TGF-β和 IFN-γ低于CD4+CD25-T細胞(P＜0.01)，有無 GVHD 患者兩細胞混合分泌的這3種細胞因子均低于CD4+CD25-T細胞(P＜0.05)。這些均與對照組類似。見表 2、3、4。

3 討論

表2 各組CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T細胞分泌 IL-10結果(mmol/L，)

表2 各組CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T細胞分泌 IL-10結果(mmol/L，)

注:與同組CD4+CD25-T細胞比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T細胞 混合細胞對照組 7 6.67 ±2.58＊＊ 35.71 ±5.28 22.57 ±4.82*GVHD 組 1611.52 ±4.89＊＊ 41.06 ±5.59 25.34 ±5.02*無 GVHD 組 2010.25 ±3.21＊＊ 38.65 ±4.39 26.37 ±4.52*

表3 各組CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T 細胞分泌 TGF-β結果(mmol/L，)

表3 各組CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T 細胞分泌 TGF-β結果(mmol/L，)

注:與同組CD4+CD25-T細胞比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T細胞 混合細胞對照組 74.87 ±2.52＊＊ 14.27 ±2.35 8.32 ±3.58*GVHD 組 165.23 ±2.91＊＊ 18.27 ±3.72 11.69 ±4.57*無 GVHD 組 205.09 ±2.83＊＊ 16.49 ±3.81 10.63 ±3.59*

表4 CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T 細胞分泌 IFN-γ結果(mmol/L，)

表4 CD4+CD25+Tregs離體分泌和抑制CD4+CD25－T 細胞分泌 IFN-γ結果(mmol/L，)

注:與同組CD4+CD25-T細胞比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n CD4+CD25+Tregs CD4+CD25-T細胞 混合細胞對照組 7 7.68 ±3.26＊＊ 46.72 ±6.23 25.73 ±5.66*GVHD 組 16 9.43 ±3.18＊＊ 52.46 ±8.59 26.54 ±6.78*無 GVHD 組 2012.45 ±4.16＊＊ 61.26 ±7.48 34.86 ±5.75*

CD4+CD25+Tregs功能特征性標志為無反應性和抑制功能［2］，即 CD4+CD25+Tregs在體外對TCR激活或促有絲分裂抗體刺激下不增殖;而且在與CD4+CD25-T細胞的混合培養中，可以抑制后者產生IL-2基因的轉錄，可以抑制后者的增殖和分泌細胞因子。CD4+CD25+Tregs需通過其TCR被激活，一旦激活，其抑制功能是非特異性的［3］。CD4+CD25+Tregs還可把其抑制功能傳染給傳統的CD4+T細胞，成為傳染性耐受，這種傳染性耐受是細胞接觸依賴性，由 TGF-β 部分調節［4］。

為了檢測Allo-PBSCT受者外周血CD4+CD25+Tregs的體外功能，我們做了離體CD4+CD25+Tregs的無反應性和抑制實驗。我們發現有無GVHD移植受者的外周血CD4+CD25+體外在可溶性抗CD3-mAbs和抗CD28-mAbs的刺激下，均不增殖，表現出其無反應性。而且在與CD4+CD25-T細胞的混合培養中均可抑制CD4+CD25-T細胞的增殖和分泌細胞因子，表現出其抑制功能。這些均與正常對照組外周血CD4+CD25+Tregs的功能類似，與Beyer等［5］的研究結果相同。說明有無GVHD移植受者的外周血CD4+CD25+Tregs仍保持了正常CD4+CD25+Tregs的功能，是真正的免疫調節性T細胞。

本研究中，由于造血干細胞在受者骨髓植活，受者造血功能恢復，故CD4+CD25+Treg極有可能在受者骨髓中大量產生。其來源可能有二:一是供者的Tregs增殖，二是供者來源的非 Tregs轉化而來［6］。這些CD4+CD25+Treg保持正常免疫調節功能就可以抑制移植物中激活的T細胞，避免其對受者組織的攻擊，從而預防GVHD的發生。

總之，本實驗發現 Allo-PBSCT受者外周血CD4+CD25+Tregs具有與健康人CD4+CD25+Tregs類似的無反應性和抑制能力，說明有無GVHD移植受者的外周血CD4+CD25+Tregs仍保持了正常CD4+CD25+Tregs的體外功能，是真正的免疫調節性T細胞。如果能有效地利用Allo-PBSCT受者外周血CD4+CD25+Tregs的抑制功能，則有可能降低Allo-PBSCT后GVHD的發病率。

［1］Adeegbe D，Bayer AL，Levy RB，et al.Cutting edge:allogeneic CD4+CD25+FOXP3+T regulatory cells suppress autoimmunity while establishing transplantation tolerance［J］.J Immunol，2006，176(12):7149-7153.

［2］Takahashi T，Tagami T，Yamazaki S，et al.Immunologic self-tolerance maintained by CD4+CD25+regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4［J］.J Exp Med，2000，192(2):303-310.

［3］Thornton AM，Shevach EM.Suppressor effector function of CD4+CD25+immunoregulatory T cells is antigen nonspecific［J］.J Immunol，2000，164(1):183-190.

［4］Jonuleit H，Schmitt.The regulatory T family:distinct subsets and their interrelations［J］.J Immunol.，2003，171(12):6323-6327.

［5］Beyer M，Kochanek M，Giese T，et al.In vivo peripheral expansion of naive CD4+CD25 high FOXP3+regulatory T cells in patients with multiple myeloma［J］.Blood，2006，107(10):3940-3949.

［6］Mielke S，Rezvani K，Savani BN，et al.Reconstitution of FOXP3+regulatory T cells(Tregs)after CD25-depleted allotransplantation in elderly patients and association with acute graft-versus-host disease［J］.Blood，2007，110(5):1689-1697.