上皮鈣黏蛋白和黏附分子CD44V6及基質(zhì)金屬蛋白酶2在賁門癌中的表達及意義

安繼榮，張亞珍，劉小峰，陳樂天

賁門癌為消化道常見惡性腫瘤，占胃癌的15%～20%，占食管癌的11%～50%，發(fā)病年齡在40～70歲。賁門癌起源于食管胃結(jié)合部，在解剖組織學(xué)、生理特點、發(fā)病情況、細胞學(xué)方面有許多與胃癌不同的特征，更具有本身獨特的臨床表現(xiàn)和診治方法，其治療效果遠遜于胃癌［1］。本研究選擇近年來研究較為廣泛的與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的上皮鈣黏蛋白 (E－cadherin，E－cad)以及近年來備受關(guān)注的與癌轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的黏附分子CD44V6、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP－2)進行研究，探討三者在賁門癌中的表達及其與淋巴結(jié)浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床判斷預(yù)后及早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2006—2009年在天水市第四人民醫(yī)院行手術(shù)治療的64例賁門癌患者，其中男40例，女24例;年齡39～85歲，平均54歲;病理類型均為腺癌;賁門癌的分級按照WHO的標(biāo)準(zhǔn)分為:高分化 (Ⅰ級)9例，中分化 (Ⅱ級)24例，低分化 (Ⅲ級)31例。術(shù)前未進行放療、化療或其他特殊治療。另選取其中20例賁門癌患者的癌旁組織切片作為對照，其中男15例，女5例。賁門癌組織石蠟標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛溶液固定，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色，病理診斷證實。

1.2 主要試劑 鼠抗人E－cad蛋白單克隆抗體及SP試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。鼠抗人CD44V6單克隆抗體、鼠抗人MMP－2單克隆抗體及S－P免疫組化染色試劑盒其中包括過氧化酶阻斷液、10%非免疫動物血清、生物素標(biāo)記的第二抗體、鏈霉素抗生物素－過氧化物酶溶液，購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法 蠟塊行4 μm厚度的切片2張，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，58℃烘烤24 h。1張行HE染色復(fù)查診斷，1張行免疫組織化學(xué)研究，染色方法嚴(yán)格按照SABC試劑盒說明書步驟進行。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷 E－cad蛋白陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):E－cad著色部位為細胞膜，呈棕黃色或黃色;在高倍鏡下隨機觀察10個高倍視野，每個視野下計數(shù)1 000個細胞，陽性細胞數(shù)占全部腫瘤細胞數(shù)的百分比＞75%為表達強陽性 (+++)，51%～75%為表達陽性 (++)，25%～50%為表達弱陽性 (+)，＜25%為表達陰性 (－)。

CD44V6蛋白陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):CD44V6蛋白陽性表達主要定位于細胞膜，呈棕黃色顆粒。

MMP－2蛋白陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):MMP－2蛋白以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，即隨機選取5個高倍視野計數(shù)陽性細胞百分比平均數(shù)。無陽性細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分;著色強度以多數(shù)陽性細胞呈現(xiàn)的染色計分，無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分;將陽性細胞百分比著色強度兩者計分相加，0～2分為陰性 (－)，≥3分為陽性 (+)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用χ2檢驗計算器V 1.61軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果均采用χ2檢驗。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 賁門癌組織及癌旁組織中E－cad、CD44V6、MMP－2的表達 E－cad在癌旁組織中陽性表達率為85.7%，而CD44V6、MMP－2在癌旁組織中基本不表達，三者在賁門癌組織中的陽性表達率分別為20.6%、60.9%和64.1%，E－cad表達明顯低于癌旁組織，而CD44V6、MMP－2表達明顯高于癌旁組織，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

2.2 賁門癌組織中E－cad、CD44V6、MMP－2的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 賁門癌分化程度不同，癌組織中E－cad、CD44V6、MMP－2陽性表達率間差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P均＜0.05);隨著分化程度的降低，E－cad陽性表達率降低，而CD44V6、MMP－2陽性表達率升高。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的賁門癌組織中E－cad的陽性表達率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，而CD44V6、MMP－2的陽性表達率則顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表2)。

表1 賁門癌組織及癌旁組織中E－cad、CD44V6、MMP－2的表達比較 (例)Table1 Expression of E－cad，CD44V6，and MMP－2 in gastric cardia cancer and adjacent tissues

表2 賁門癌組織中E－cad、CD44V6、MMP－2的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系［n(%)］Table2 Relationship between E－cad，CD44V6，MMP－2 expression in cardiac tissues and the clinicopathological features of gastric cardia carcinoma

3 討論

E－cad主要介導(dǎo)同種細胞間的黏附反應(yīng)，同時又能通過細胞骨架相互傳遞信息，其結(jié)構(gòu)與功能變化直接影響腫瘤細胞脫離原發(fā)灶而發(fā)生轉(zhuǎn)移，它的變化與上皮惡性腫瘤的分化程度、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為存在著密切聯(lián)系［2］。目前，多以E－cad表達的降低或消失來判斷腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤細胞轉(zhuǎn)移［3］，國內(nèi)外有關(guān)研究表明E－cad在乳腺、肝、胃、腸、膀胱、前列腺及卵巢等惡性腫瘤中有不同程度的表達減弱或缺失。本研究結(jié)果顯示，E－cad在賁門癌中表達明顯低于癌旁組織，在高分化、中分化、低分化賁門癌組織中的陽性表達率分別為44.4%(4/9)、8.3%(2/24)和3.2%(1/31)，這說明E－cad在賁門癌中的表達與腫瘤分化程度密切相關(guān)，腫瘤病理分化程度越低，其陽性表達率越低、表達強度越弱;此外，E－cad的表達還與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者E－cad陽性表達率分別為20.7%和2.9%，說明E－cad表達的越低，腫瘤區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性越高，所以E－cad表達的檢測與賁門癌細胞分化程度、病理分級及局部淋巴結(jié)侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，它將可能成為判斷預(yù)后較有價值的客觀指標(biāo)之一。

CD44指白細胞分化抗原分化簇第44號，是一個典型的單拷貝基因多種表型的細胞表面跨膜蛋白多糖分子，位于人類CD44基因的11號染色體短臂上 (11p13)，分為兩種:標(biāo)準(zhǔn)型CD44(CD44s)和變異型CD44(CD44V)，后者主要包括CD44V3、CD44V5、CD44V6、CD44V9等。CD44具有重要的生物學(xué)功能，如局部透明質(zhì)酸的清除、淋巴細胞歸巢、T細胞激活、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等，CD44V6是第一個被發(fā)現(xiàn)與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的CD44黏附分子，在多種腫瘤中表達能顯著增強腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［4］。本組患者CD44V6在高分化、中分化、低分化組織中的陽性表達率分別為2/9、37.5%和90.3%，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組37.9%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組80.0%，表明CD44V6與賁門癌的細胞分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，今后有可能把它作為判斷預(yù)后的指標(biāo)之一。

基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)是降解基質(zhì)最重要的酶類，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系。MMP－2是MMPs家族中重要成員，不僅能降解細胞間基質(zhì)，還能降解基質(zhì)膠原，有利于細胞遷移，是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的生化基礎(chǔ)［5］。本研究發(fā)現(xiàn)MMP－2在癌旁組織中基本不表達，在賁門癌組織中的陽性表達率為64.1%，并且MMP－2在高分化、中分化、低分化癌組織中的陽性表達率分別為3/9、41.7%和90.3%，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組MMP－2陽性表達率分別為48.3%和77.1%，提示MMP－2在降解細胞外基質(zhì)及基底膜的同時促進了腫瘤細胞沿著缺失的基底膜向周圍組織浸潤，進而增強了腫瘤血管生成作用，最終導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，這說明MMP－2與賁門癌的基質(zhì)浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，E－cad、CD44V6、MMP－2可能成為賁門癌臨床診斷、判斷預(yù)后及療效的敏感指標(biāo)，并可能用于臨床基因治療，聯(lián)合檢測對判斷治療療效有重要意義，但還需要進一步大量病例分析總結(jié)。

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3 王永興，姜永光.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在前列腺癌中的研究進展［J］.臨床泌尿外科雜志，2011，2(4):306－307.

4 周榮平.黏附分子CD44的表達與大腸癌生物學(xué)特性間的關(guān)系［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)雜志，2011，19(3):492－493.

5 王秀清，劉惠民，趙琰龍，等.乳腺癌組織中CD44V6和MMP－2的表達及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)雜志，2011，19(2):272－273.