上皮鈣黏蛋白和黏附分子CD44V6及基質金屬蛋白酶2在賁門癌中的表達及意義

安繼榮，張亞珍，劉小峰，陳樂天

賁門癌為消化道常見惡性腫瘤，占胃癌的15%～20%，占食管癌的11%～50%，發病年齡在40～70歲。賁門癌起源于食管胃結合部，在解剖組織學、生理特點、發病情況、細胞學方面有許多與胃癌不同的特征，更具有本身獨特的臨床表現和診治方法，其治療效果遠遜于胃癌［1］。本研究選擇近年來研究較為廣泛的與腫瘤轉移密切相關的上皮鈣黏蛋白 (E－cadherin，E－cad)以及近年來備受關注的與癌轉移高度相關的黏附分子CD44V6、基質金屬蛋白酶2(MMP－2)進行研究，探討三者在賁門癌中的表達及其與淋巴結浸潤轉移的關系，為臨床判斷預后及早期發現轉移提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2006—2009年在天水市第四人民醫院行手術治療的64例賁門癌患者，其中男40例，女24例;年齡39～85歲，平均54歲;病理類型均為腺癌;賁門癌的分級按照WHO的標準分為:高分化 (Ⅰ級)9例，中分化 (Ⅱ級)24例，低分化 (Ⅲ級)31例。術前未進行放療、化療或其他特殊治療。另選取其中20例賁門癌患者的癌旁組織切片作為對照，其中男15例，女5例。賁門癌組織石蠟標本及癌旁組織標本均經10%甲醛溶液固定，4 μm厚連續切片，HE染色，病理診斷證實。

1.2 主要試劑 鼠抗人E－cad蛋白單克隆抗體及SP試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司。鼠抗人CD44V6單克隆抗體、鼠抗人MMP－2單克隆抗體及S－P免疫組化染色試劑盒其中包括過氧化酶阻斷液、10%非免疫動物血清、生物素標記的第二抗體、鏈霉素抗生物素－過氧化物酶溶液，購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法 蠟塊行4 μm厚度的切片2張，貼于經多聚賴氨酸處理的玻片上，58℃烘烤24 h。1張行HE染色復查診斷，1張行免疫組織化學研究，染色方法嚴格按照SABC試劑盒說明書步驟進行。DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固，以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

1.4 結果判斷 E－cad蛋白陽性判斷標準:E－cad著色部位為細胞膜，呈棕黃色或黃色;在高倍鏡下隨機觀察10個高倍視野，每個視野下計數1 000個細胞，陽性細胞數占全部腫瘤細胞數的百分比＞75%為表達強陽性 (+++)，51%～75%為表達陽性 (++)，25%～50%為表達弱陽性 (+)，＜25%為表達陰性 (－)。

CD44V6蛋白陽性判斷標準:CD44V6蛋白陽性表達主要定位于細胞膜，呈棕黃色顆粒。

MMP－2蛋白陽性判斷標準:MMP－2蛋白以細胞質中出現棕黃色顆粒為陽性，即隨機選取5個高倍視野計數陽性細胞百分比平均數。無陽性細胞為0分，≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分;著色強度以多數陽性細胞呈現的染色計分，無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分;將陽性細胞百分比著色強度兩者計分相加，0～2分為陰性 (－)，≥3分為陽性 (+)。

1.5 統計學方法 使用χ2檢驗計算器V 1.61軟件分析數據，結果均采用χ2檢驗。P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 賁門癌組織及癌旁組織中E－cad、CD44V6、MMP－2的表達 E－cad在癌旁組織中陽性表達率為85.7%，而CD44V6、MMP－2在癌旁組織中基本不表達，三者在賁門癌組織中的陽性表達率分別為20.6%、60.9%和64.1%，E－cad表達明顯低于癌旁組織，而CD44V6、MMP－2表達明顯高于癌旁組織，兩組間差異有統計學意義 (P＜0.05，見表1)。

2.2 賁門癌組織中E－cad、CD44V6、MMP－2的表達與患者臨床病理特征的關系 賁門癌分化程度不同，癌組織中E－cad、CD44V6、MMP－2陽性表達率間差異有統計學意義 (P均＜0.05);隨著分化程度的降低，E－cad陽性表達率降低，而CD44V6、MMP－2陽性表達率升高。

淋巴結轉移的賁門癌組織中E－cad的陽性表達率顯著低于無淋巴結轉移者，而CD44V6、MMP－2的陽性表達率則顯著高于無淋巴結轉移者，差異均有統計學意義 (P＜0.05，見表2)。

表1 賁門癌組織及癌旁組織中E－cad、CD44V6、MMP－2的表達比較 (例)Table1 Expression of E－cad，CD44V6，and MMP－2 in gastric cardia cancer and adjacent tissues

表2 賁門癌組織中E－cad、CD44V6、MMP－2的表達與患者臨床病理特征的關系［n(%)］Table2 Relationship between E－cad，CD44V6，MMP－2 expression in cardiac tissues and the clinicopathological features of gastric cardia carcinoma

3 討論

E－cad主要介導同種細胞間的黏附反應，同時又能通過細胞骨架相互傳遞信息，其結構與功能變化直接影響腫瘤細胞脫離原發灶而發生轉移，它的變化與上皮惡性腫瘤的分化程度、侵襲、轉移等生物學行為存在著密切聯系［2］。目前，多以E－cad表達的降低或消失來判斷腫瘤細胞上皮間質轉化和腫瘤細胞轉移［3］，國內外有關研究表明E－cad在乳腺、肝、胃、腸、膀胱、前列腺及卵巢等惡性腫瘤中有不同程度的表達減弱或缺失。本研究結果顯示，E－cad在賁門癌中表達明顯低于癌旁組織，在高分化、中分化、低分化賁門癌組織中的陽性表達率分別為44.4%(4/9)、8.3%(2/24)和3.2%(1/31)，這說明E－cad在賁門癌中的表達與腫瘤分化程度密切相關，腫瘤病理分化程度越低，其陽性表達率越低、表達強度越弱;此外，E－cad的表達還與腫瘤淋巴結轉移密切相關，本研究發現淋巴結未轉移者與淋巴結轉移者E－cad陽性表達率分別為20.7%和2.9%，說明E－cad表達的越低，腫瘤區域淋巴結轉移的可能性越高，所以E－cad表達的檢測與賁門癌細胞分化程度、病理分級及局部淋巴結侵襲和轉移密切相關，它將可能成為判斷預后較有價值的客觀指標之一。

CD44指白細胞分化抗原分化簇第44號，是一個典型的單拷貝基因多種表型的細胞表面跨膜蛋白多糖分子，位于人類CD44基因的11號染色體短臂上 (11p13)，分為兩種:標準型CD44(CD44s)和變異型CD44(CD44V)，后者主要包括CD44V3、CD44V5、CD44V6、CD44V9等。CD44具有重要的生物學功能，如局部透明質酸的清除、淋巴細胞歸巢、T細胞激活、腫瘤形成和轉移等，CD44V6是第一個被發現與腫瘤轉移有關的CD44黏附分子，在多種腫瘤中表達能顯著增強腫瘤細胞的侵襲轉移能力［4］。本組患者CD44V6在高分化、中分化、低分化組織中的陽性表達率分別為2/9、37.5%和90.3%，淋巴結未轉移組37.9%，淋巴結轉移組80.0%，表明CD44V6與賁門癌的細胞分化程度及淋巴結轉移有密切關系，今后有可能把它作為判斷預后的指標之一。

基質金屬蛋白酶 (MMPs)是降解基質最重要的酶類，與腫瘤的侵襲、轉移有密切的聯系。MMP－2是MMPs家族中重要成員，不僅能降解細胞間基質，還能降解基質膠原，有利于細胞遷移，是腫瘤浸潤轉移的生化基礎［5］。本研究發現MMP－2在癌旁組織中基本不表達，在賁門癌組織中的陽性表達率為64.1%，并且MMP－2在高分化、中分化、低分化癌組織中的陽性表達率分別為3/9、41.7%和90.3%，淋巴結未轉移組和淋巴結轉移組MMP－2陽性表達率分別為48.3%和77.1%，提示MMP－2在降解細胞外基質及基底膜的同時促進了腫瘤細胞沿著缺失的基底膜向周圍組織浸潤，進而增強了腫瘤血管生成作用，最終導致腫瘤侵襲轉移，這說明MMP－2與賁門癌的基質浸潤及淋巴結轉移密切相關。

綜上所述，E－cad、CD44V6、MMP－2可能成為賁門癌臨床診斷、判斷預后及療效的敏感指標，并可能用于臨床基因治療，聯合檢測對判斷治療療效有重要意義，但還需要進一步大量病例分析總結。

1 李澤堅.實用臨床胸外科學［J］.北京:科學技術文獻出版社，2007:424－425.

2 李小俊，馬秀英.黏附分子與腫瘤侵襲和轉移研究進展［J］.現代腫瘤醫學雜志，2011，19(3):615－616.

3 王永興，姜永光.上皮間質轉化在前列腺癌中的研究進展［J］.臨床泌尿外科雜志，2011，2(4):306－307.

4 周榮平.黏附分子CD44的表達與大腸癌生物學特性間的關系［J］.現代腫瘤醫學雜志，2011，19(3):492－493.

5 王秀清，劉惠民，趙琰龍，等.乳腺癌組織中CD44V6和MMP－2的表達及其與淋巴結轉移關系［J］.現代腫瘤醫學雜志，2011，19(2):272－273.