輕、中度持續哮喘患者治療前后氣道高反應性及致氣道重塑細胞因子變化研究

武虹艷，萬毅新，王曉平，陶紅艷，魏海東，王 虹，黃暉蓉，李芳偉

支氣管哮喘是以氣道慢性炎癥、氣道高反應性 (BHR)以及可逆性氣流受限為特征的慢性疾病。氣道慢性炎癥和氣道重塑被認為是導致氣道高反應性的關鍵。氣道重塑最終導致哮喘患者氣流受限不可逆，上皮下纖維化是氣道重塑最主要的特征，而Thl和Th2細胞亞群失衡，即Th2型優勢應答在上皮下纖維化的形成過程中發揮重要作用。轉錄因子T－bet和GATA－3是特異性調控Th0分化為Thl、Th2的關鍵因子。盡管哮喘的這些特性已被人們所認識，但是導致氣道重塑的機制和藥物治療在減緩并阻止氣道重塑的效果并不十分清楚。大量的細胞和細胞因子參與氣道炎癥及氣道重塑的形成，形成一個復雜的網絡。TGF－β1被認為是氣道炎癥和氣道重塑的關鍵調節因子。本研究通過檢測輕中度持續哮喘患者長期吸入小劑量布地奈德粉劑治療前后氣道高反應性的變化，氣道黏膜組織中TGF－β1、T－bet及GATA－3的表達及其相關性，試圖探討治療前后輕、中度持續哮喘患者氣道高反應性及致氣道重塑細胞因子表達的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料 哮喘組:選取2006年6月—2009年6月就診于蘭州大學第二醫院呼吸內科的輕、中度持續哮喘患者28例，胸片無異常表現，診斷標準符合中華醫學會呼吸病學分會2003年《支氣管哮喘防治指南》。其中男16例，女12例，平均年齡 (52.69±15.75)歲，平均身高 (165.28±9.84)cm，平均體質量 (65.23±14.65)kg。28例患者均符合以下入選條件:(1)年齡25～85歲;(2)無心、肝、腎功能不全和精神異常;(3)非孕婦或哺乳期婦女;(4)納入前無吸入糖皮質激素治療史。對照組:選擇2006年6月—2009年6月就診于蘭州大學第二醫院體檢中心的健康體檢者10例，無哮喘病史，肺功能正常。其中男6例，女4例，平均年齡 (49.92±14.83)歲，平均身高 (168.52±7.92)cm，平均體質量(68.33±13.46)kg，兩組患者一般資料間有均衡性。

1.2 研究方法

1.2.1 氣管鏡檢查方法與標本采集 氣管鏡操作依據BTS指南［1］進行，受試者術前應用2%利多卡因做口咽部局麻。應用電子支氣管鏡在右肺下葉取支氣管黏膜組織3～4塊置于10%福爾馬林溶液中，并用石蠟包埋。入組后哮喘患者規律吸入布地奈德200μg［商品名:普米可都保，阿斯利康 (無錫)貿易有限公司生產，生產批號:MK896，國藥準字:H20080249］，2次/d，持續12個月。治療12個月后，哮喘患者再行電子支氣管鏡檢查并于同一部位取支氣管黏膜組織2～3塊，置于10%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，待全部標本收集完全后進行免疫組化染色。

1.2.2 免疫組化方法及試劑 免疫組化采用SABC(Strept Avidin－Biotin Complex)法，免疫組化試劑均購買于武漢博士德公司，均為兔抗人多克隆抗體濃縮型。

1.2.3 數據采集 采用病理圖像分析儀BI—2000(成都泰盟科技有限公司生產)半定量測定TGF－β1、T－bet、GATA－3表達量，以免疫組化染色平均光密度值表示。

1.2.4 肺功能與氣道高反應性測定方法 使用德國JAEGER公司肺功能儀及霧化激發系統，按美國胸科協會肺功能檢測標準操作。主要檢測指標如下:第1 s用力呼氣容積 (FEV1)、峰值呼氣流速 (PEF)、1 s率 (FEV1/FVC)，測定結果以實測值占預計值的百分比表示，以校正性別、年齡、身高、體質量等因素的影響。以乙酰甲膽堿為誘發劑，激發劑濃度依次遞增，以引起FEV1下降超過20%時吸入的乙酰甲膽堿濃度為激發閾值，即FEV1＜16 mg/ml判斷為支氣管激發試驗陽性，存在氣道高反應性。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行分析，正態分布的計量資料以(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，并應用Pearson相關分析與多元回歸分析進行相關性分析。檢驗水準α取值0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺功能指標的改善情況 28例哮喘患者使用布地奈德粉吸入劑12個月后，PEF、FEV1、引起FEV1下降20%的激發劑濃度 (PC20)均有顯著改善，差異有統計學意義 (P＜0.01)。Pearson相關分析顯示，PC20與治療前后TGF－β1、T－bet表達無相關性，但與治療前GATA－3呈負相關 (r=－0.836，P＜0.01)，具體見表1。

哮喘組治療前氣道黏膜組織中TGF－β1的表達強度高于對照組 (t=4.51，P＜0.01)，治療后氣道黏膜組織中TGF－β1的表達強度仍高于對照組 (t=2.71，P＜0.05)，但低于治療前氣道黏膜組織中TGF－β1的表達，差異有統計學意義 (t=2.58，P＜0.05)，具體見表1。

哮喘組治療前氣道黏膜組織中T－bet的表達強度低于對照組 (t=－21.72，P＜0.01)，治療后氣道黏膜組織中T－bet的表達強度仍低于對照組 (t=－16.29，P＜0.01)，但高于治療前氣道黏膜組織中T－bet的表達，差異有統計學意義 (t=－3.81，P＜0.01)，具體見表1。

哮喘組治療前氣道黏膜組織中GATA－3的表達強度高于對照組 (t=6.16，P＜0.01)，治療后氣道黏膜組織中GATA－3的表達強度仍高于對照組 (t=4.52，P＜0.01)，但低于治療前氣道黏膜組織中GATA－3的表達，差異有統計學意義(t=2.24，P＜0.05)，具體見表1。

表1 治療前后哮喘組與對照組各研究指標的比較(±s)Table1 Comparison of indicators between the patient group and the control group before and after treatment

表1 治療前后哮喘組與對照組各研究指標的比較(±s)Table1 Comparison of indicators between the patient group and the control group before and after treatment

注:與對照組比較，經獨立樣本t檢驗，*P＜0.01;與對照組比較，經獨立樣本t檢驗，△P＜0.05;與治療前比較，經配對樣本t檢驗，▲P＜0.01;與治療前比較，經配對樣本t檢驗，●P＜0.05。FEV1=第1 s用力呼氣容積，PEF=峰值呼氣流速，FEV1/FVC=1 s率，PC20=引起FEV1下降20%的激發劑濃度

指標 哮喘組 (n=28)治療前 治療后 對照組 (n=10)FEV1(%pred.value) 84.75±18.40* 97.38±16.42＊▲0.28±0.01 107.79±8.10 PEF(%pred.value) 68.27±19.20* 85.56±22.11＊▲ 98.62±12.47 FEV1/FVC 74.82±11.57 78.36± 7.83 83.2± 9.36 PC20(mg/ml) 5.68± 2.81* 9.89± 6.40▲ ＞16 TGF－β1 0.30± 0.02* 0.28± 0.01Δ● 0.27± 0.01 T－bet 0.21± 0.01* 0.23± 0.01＊▲ 0.29± 0.01 GATA－3 0.34± 0.03* 0.31± 0.02＊●

2.2 細胞因子TGF－β1與轉錄因子T－bet、GATA－3的相關性 分別以治療前后轉錄因子T－bet、GATA－3為自變量X，細胞因子TGF－β1為應變量Y建立回歸方程。采用逐步回歸的方法，按α=0.05的水準，治療前變量T－bet、GATA－3被選入。回歸方程:治療前細胞因子TGF－β1:Y=0.372－0.334X1;治療前細胞因子TGF－β1:Y=1.152X2－0.1020，X1為治療前變量T－bet;X2為治療前變量GATA－3。治療后變量T－bet、GATA－3未被選入。

3 討論

本研究顯示輕、中度持續哮喘患者長期吸入小劑量布地奈德粉劑后，PEF、FEV1較治療前明顯改善，氣道高反應性較治療前明顯減低，本研究結果與目前研究結果結論一致［2］。本研究發現治療前PC20與GATA－3呈負相關，我們采用半定量分析，沒有測定血液中細胞因子的表達量，但是該研究結果與目前的研究結果一致［3］，治療后并未發現它們之間存在相關關系。Boulet等［4］提出假設認為氣道高反應性反映了氣道慢性炎癥和氣道重塑之間的復雜關系，很難用簡單的相關關系解釋復雜的臨床結果與病理過程之間的關系。因此，我們推斷氣道高反應性的發生不僅與氣道炎癥及氣道平滑肌功能紊亂有關，還有許多細胞因子參與，有待于進一步研究。本研究顯示哮喘組TGF－β1表達高于對照組。目前關于哮喘患者氣道黏膜中TGF－β1表達的結論并不一致，Torrego等［5］關于人氣道黏膜中TGF－β1表達的研究結果顯示，TGF－β1表達并沒有規律性;但多數研究結果顯示TGF－β1表達在哮喘患者的支氣管黏膜中增加［6－7］。研究結果不一致的原因并不十分清楚，但是以上研究均采用免疫組化的方法，該研究方法步驟較多，任何一個步驟出現偏差都會影響實驗結果。本研究結果提示治療后可有效減少TGF－β1表達，與相關研究結果相一致［8－9］，哮喘患者氣道黏膜中TGF－β1表達增高，導致成纖維細胞分泌大量膠原，轉化生長因子TGF－β1也可促使成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，后者具有更強的膠原合成能力，由此推斷在臨床中吸入糖皮質激素可有效抑制TGF－β1的表達，起到延緩氣道重塑進程的作用。

本研究顯示哮喘組轉錄因子T－bet的表達與對照組相比明顯減少，治療后其在支氣管黏膜中的表達較治療前有所增加，但其表達仍低于對照組。本研究顯示哮喘組轉錄因子GATA－3的表達，與對照組相比明顯增加，治療后其表達較治療前有所減少，但仍高于對照組。本研究結果提示吸入小劑量布地奈德粉吸入劑可有效增加輕、中度持續哮喘患者氣道黏膜中具有負性調節Th2優勢應答作用的轉錄因子T－bet表達，并減少促進Th2優勢應答作用的轉錄因子GATA－3的表達，該研究結果與Liberman等［10－11］研究結果相一致。

TGF－β1、T－bet、GATA－3均被認為在氣道重塑的過程中發揮了重要作用［12－14］，但T－bet、GATA－3在氣道重塑形成過程中發揮的準確作用并不清楚，本研究通過分析它們之間的相關關系發現治療前T－bet的表達與TGF－β1呈負相關;GATA－3的表達與TGF－β1呈正相關。因此我們設想轉錄因子T－bet、GATA－3在調控Th0細胞的分化中受TGF－β1的影響，即TGF－β1通過調控T－bet、GATA－3的表達從而間接調控Th0細胞的分化。治療后TGF－β1、T－bet、GATA－3的表達均有改變，但它們之間并沒有明顯的相關關系，本研究通過觀察肺功能參數及免疫組化的參數在治療前后的變化，間接研究吸入糖皮質激素對氣道重塑的影響。由此我們推斷長期吸入小劑量布地奈德對哮喘患者致氣道重塑的細胞因子均有影響，但其受影響程度不同。由于以上因子只是哮喘氣道高反應性及氣道重塑形成過程中發揮調控作用的一小部分因子，因此，簡單的從實驗數據的相關性來推斷它們之間存在的復雜關系仍不可取。根據本研究的數據、結果以及相關研究資料，我們認為TGF－β1在調節T－bet、GATA－3平衡中發揮著重要作用，但最終結果是由微環境以及多種細胞因子、轉錄因子共同決定的，甚至在不同的微環境中，其受調控方向也不同，其中一定有更為復雜的細胞因子網絡在發揮作用，還需要進一步研究。

哮喘患者氣道黏膜中的確存在TGF－β1的表達紊亂與T－bet、GATA－3表達失衡，長期吸入小劑量布地奈德可有效改善輕、中度持續哮喘患者的肺功能指標，降低氣道高反應性，抑制致氣道重塑細胞因子的表達，調節T－bet、GATA－3表達失衡。

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