小檗堿對潑尼松性大鼠腦損害的防治作用

陳文雙 張新樂 徐道華 (廣東醫學院藥理教研室，廣東 湛江 524023)

長期大劑量使用糖皮質激素對腦損害的作用十分突出。血漿中高水平的糖皮質激素持續作用可以透過血腦屏障進入腦組織，危害中樞神經系統〔1〕。為探討小檗堿在改善潑尼松性大鼠腦損害方面的作用，本研究擬采用大劑量醋酸潑尼松致大鼠腦損害模型，觀察潑尼松對大鼠腦組織單胺氧化酶(MAO)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及腦組織結構的影響，以及小檗堿對潑尼松大鼠腦損害的防治作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 SPF級3月齡SD大鼠50只，雄性，250～285 g，廣東醫學院實驗動物中心提供。按體重隨機分成5組，每組10只，空白對照組(Con組)，予蒸餾水5 ml/kg灌胃1 h后再予蒸餾水 5 ml/kg灌胃;潑尼松組(GC組)，予潑尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后再予蒸餾水5 ml/kg灌胃;小檗堿低劑量組〔GC+Ber(L)組〕，先予潑尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后予小檗堿15 mg/kg灌胃;小檗堿中劑量組〔GC+Ber(M)組〕，先予潑尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后予小檗堿30 mg/kg灌胃;小檗堿高劑量組〔GC+Be(H)組〕，先予潑尼松3.5 mg/kg灌胃1 h后予小檗堿60 mg/kg灌胃。1次/d，所有動物給藥時間為12 w。

1.2 方法

1.2.1 試劑、藥品與儀器 小檗堿(純度95%，Sigma公司)，臨用前用蒸餾水配制;醋酸潑尼松(純度99%，浙江仙居藥業有限公司)，臨用前用少許吐溫-80溶解后用蒸餾水稀釋至所需容積;MAO測定試劑盒、SOD測定試劑盒和考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。儀器:ELX800型酶標儀(美國BD-Tek公司)，752紫外光柵分光光度計(上海第三分析儀器廠)，LEICA QWIN圖像分析儀(德國萊卡公司)，ZS832I型內切式組織勻漿機(浙新機械廠)，ASD23D愛華電子秤(深圳市愛華儀器有限公司)。

1.2.2 模型制備 采用醋酸潑尼松3.5 mg/kg灌胃大鼠，1次/d，連續給藥12 w，建立潑尼松致大鼠腦損害的模型。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 腦勻漿生化指標測定 大鼠右心室取血后，迅速斷頭，立即取出完整大腦，左側大腦先于－20℃預存，48 h內在冰浴上用4℃生理鹽水研磨制成10%腦勻漿，再經ZS832I型內切式組織勻漿機充分粉碎，離心取上清檢測MAO、SOD和腦勻漿蛋白含量。

1.2.3.2 腦組織切片標本制備方法 打開大鼠顱骨，取出完整大腦，觀察外觀有無特征性改變;然后將右側大腦用Bouin固定液固定進行常規石蠟包埋切片。根據包新民等〔2〕大鼠腦立體定位圖譜在距離前囟向尾側3～4 mm處修理組織塊，行冠狀切片，在距離前囟向尾側約3.5 mm處連續切片5～8張，厚4 mm，經HE染色后，分別于高倍光鏡下觀察組織結構變化，并用半自動圖像分析儀測算海馬CA2區單位面積神經元數目(大錐體細胞計數)，測量大鼠大腦紋狀區皮質分子層厚度和皮層總厚度。

2 結果

2.1 小檗堿對潑尼松大鼠腦勻漿生化指標的影響 見表1。與空白對照組比較，潑尼松組大鼠大腦勻漿中MAO含量顯著升高(P＜0.01)，而SOD的含量變化不明顯，提示長期使用潑尼松可使大鼠神經系統功能活動受到限制，出現衰老的跡象。與潑尼松組比較，小檗堿高、中、低劑量組均可顯著降低MAO的含量(P＜0.01)，提示小檗堿可在一定程度上可對抗潑尼松的中樞性不良反應。

2.2 小檗堿對潑尼松大鼠腦組織結構影響 打開大鼠顱骨，取出完整大腦時，觀察各組大鼠大腦外觀無顯著差異，未見明顯的腫脹、萎縮或顏色變化。顯微鏡下可見空白對照組海馬神經元分布規則，大小一致;而長期使用潑尼松后大鼠海馬CA2區神經元排列分散，胞體腫脹或皺縮，有較多的神經細胞發生核固縮甚至溶解死亡。小檗堿預防藥物組海馬CA2區神經元排列較規則，正常形態的神經元細胞數目較多(圖1)。通過圖像分析儀測量，與空白對照組比，長期應用潑尼松后大鼠海馬CA2區單位面積大錐體細胞數(HN)明顯下降(P＜0.01)，分子層厚度和皮層的總厚度比值(M/C)無顯著變化，提示長期超生理劑量使用潑尼松可造成大鼠海馬神經元的損傷。與潑尼松組比較，小檗堿高、中、低劑量組HN均顯著上升(P＜0.01)，M/C無明顯變化，提示小檗堿對潑尼松造成的神經細胞損傷有一定的預防作用。見表2。

表1 小檗堿對潑尼松大鼠腦勻漿SOD活性與MAO含量的影響(± s，U/mg prot，n=10)

表1 小檗堿對潑尼松大鼠腦勻漿SOD活性與MAO含量的影響(± s，U/mg prot，n=10)

與Con組比較:1)P＜0.01;與GC組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01，下表同

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表2 小檗堿對潑尼松大鼠腦組織結構的影響(± s，n=10)

表2 小檗堿對潑尼松大鼠腦組織結構的影響(± s，n=10)

CW:大腦皮層厚度

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圖1 各組大鼠海馬CA2區神經元細胞(錐體細胞)形態(HE，×400)

3 討論

目前臨床醫師對糖皮質激素的急性期不良反應比較重視，如高血壓、高血糖、尿糖、胃腸出血和穿孔、心肌肥厚及對下丘腦-垂體-腎上腺軸一過性的抑制作用等〔3，4〕，對遠期中樞神經系統的不良反應卻未引起足夠重視。而大量動物實驗表明，糖皮質激素治療對腦發育有不良影響，糖皮質激素通過抑制腦胸腺嘧啶脫氧核苷酸激酶(可調節DNA的合成速度)的活性，影響嘧啶核苷酸的生物合成，使腦細胞數目明顯減少、腦重量減輕，從而導致生長發育明顯延遲〔3〕。實驗中潑尼松組大鼠腦勻漿中MAO含量顯著上升，提示糖皮質激素造成的腦損害與其腦中神經遞質含量紊亂有關。海馬是腦內參與記憶的重要部分，其結構的改變往往提示記憶功能下降，記憶衰退是生物體出現衰老的一個早期癥狀〔5〕。糖皮質激素損傷海馬的機制可能與加速神經元內ATP消耗，引起細胞器退行性變和能量的大量消耗有關〔6〕。本實驗結果也顯示長期使用糖皮質激素可造成海馬神經細胞死亡或加速神經元退化。

本實驗顯示，小檗堿對長期超生理劑量應用糖皮質激素導致的腦損害有一定預防作用。小檗堿通過減低局部缺血損傷和N-甲基天冬氨酸受體1免疫反應性〔7〕保護神經用。另外，小檗堿通過增加海馬和額葉皮質中去甲腎上腺素(NA)和5-羥色胺(5-HT)的表達水平，也起到調節神經系統的作用〔8〕。

1 孫紅宇.糖皮質激素對海馬神經元影響的體外研究 (碩士論文)〔D〕，2002:2.

2 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京:人民衛生出版社，1991:41-53.

3 Stark AR，Carlo WA，Tyson JE，et al.Adverse effects of early dexamethasone in extremely-low-birth-weight infants〔J〕.N Engl J Med，2001;344(2):95-101.

4 Anday EK，Conway D.Steroid therapy in the high-risk neonate:benefits and risks〔J〕.Clin Obstet Gynecol，2003;46(1):190-210.

5 張 兵，侯家驥.大鼠海馬CA1區錐體細胞神經元在衰老過程中的超微結構變化〔J〕.神經解剖學雜志，1995;1(3):249-52.

6 王旭明，朱吉林，黃 瀛.持續糖皮質激素增高對海馬的毒性作用〔J〕.解剖學雜志，1996;19(1):48-5.

7 Yoo KY，Hwang IK，Lim BO，et al.Berberry extract reduces neuronal damage and N-Methyl-D-aspartate receptor 1 immunoreactivity in the gerbil hippocampus after transient forebrain ischemia〔J〕.Biol Pharm Bull，2006;29(4):623-8.

8 Peng WH，Lo KL，Lee YH，et al.Berberine produces antidepressant-like effects in the forced swim test and in the tail suspension test in mice〔J〕.Life Sci，2007;81(11):933-8.