三氯化鑭對CBRH-7919細(xì)胞CDK4和P21蛋白表達(dá)的影響

楊立明 姜文平 姜文華 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，吉林 長春 300)

肝癌是世界上最常見的腫瘤之一，死亡率居第三，并且其發(fā)病率還在逐年上升〔1〕。目前雖然治療方法很多，但效果都不理想，臨床效果差，死亡率高〔2〕。國內(nèi)外近年的研究表明稀土化合物具有明顯的抑瘤性能〔3～5〕。但有關(guān)稀土化合物對肝癌細(xì)胞周期影響的研究報(bào)道非常少見。本實(shí)驗(yàn)以稀土化合物在體內(nèi)外均有明顯的抑瘤性能為理論基礎(chǔ)，以大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919為研究對象，探討稀土化合物三氯化鑭(LaCl3)是否能阻抑CBRH-7919細(xì)胞的異常調(diào)控，從而阻止腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展，阻止腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 LaCl3由北京稀土農(nóng)用中心提供;DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、胰酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)均為Gibco公司產(chǎn)品;RNA酶、碘化丙啶(PI)為Sigma公司產(chǎn)品;細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4(CDK4)和P21免疫細(xì)胞化學(xué)試劑盒為Santa Cruz公司產(chǎn)品，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 細(xì)胞株 大鼠肝癌細(xì)胞株CBRH-7919，購于中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 分組 實(shí)驗(yàn)分為3組;對照組:CBRH-7919培養(yǎng)在含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中;實(shí)驗(yàn)組分為兩組:CBRH-7919細(xì)胞分別培養(yǎng)在含0.10和1.00 mmol/L LaCl3的DMEM培養(yǎng)液中。培養(yǎng)時(shí)間分別為1、3、5 d。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)(FCM) 每組收集細(xì)胞5×106個(gè)，固定于70%冷乙醇中，4℃過夜。加入0.01%RNA 酶 10 ～15 μl，37℃水浴30 min，加0.25%PI染色劑(避光)染色30 min，作流式細(xì)胞儀檢測。每組隨機(jī)檢測1×105個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各期細(xì)胞比例。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) CBRH-7919細(xì)胞，培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中(每孔含3×103個(gè)細(xì)胞)12 h后，分別加入含不同劑量的LaCl3的DMEM培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)1、3、5 d。在上述各時(shí)間點(diǎn)作用結(jié)束前4 h每孔加 MTT(5 g/L)20 μl。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入DMSO 溶液 100 μl，作用 10 min，用酶標(biāo)儀(波長 570 nm)測定各孔吸光度值(OD值)。

1.2.4 集落形成實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的CBRH-7919細(xì)胞，每瓶100個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)12 h后，加入前述濃度的LaCl3，每組設(shè)6瓶，連續(xù)培養(yǎng)9 d。常規(guī)固定、蘇木精染色后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)多于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)方法 CDK4和P21均采用親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)法，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算其陽性率。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照，以確定免疫細(xì)胞化學(xué)染色的特異性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，OD值、集落形成數(shù)量，采用單因素方差分析;G0/G1期、S期比率及CDK4和P21蛋白表達(dá)的陽性率進(jìn)行組間的χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞生長及集落形成的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.10 mmol/L LaCl3作用3 d即對CBRH-7919細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用;隨著LaCl3劑量的增加和作用時(shí)間的延長，對CBRH-7919細(xì)胞生長的抑制作用也增強(qiáng)。集落形成實(shí)驗(yàn)顯微鏡下觀察可見，對照組集落滿視野，體積大;0.1 mmol/L LaCl3組集落分布稀疏，體積較小;1 mmol/L LaCl3組集落偶見，體積小。0.1、1 mmol/L LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞的集落形成具有明顯的抑制作用，呈劑量依賴性。見表1。

2.2 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞G0/G1期及S期的影響 流式細(xì)胞儀結(jié)果可見，CBRH-7919細(xì)胞經(jīng)0.1、1 mmol/L LaCl3作用1、3、5 d后，G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增加，S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。見表2。

2.3 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞CDK4和P21表達(dá)的影響 CDK4免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著LaCl3劑量與時(shí)間的增加，陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，著色強(qiáng)度也越來越弱;0.10 mmol/L 和 1.00 mmol/L LaCl3組1、3、5 d CDK4 表達(dá)均明顯減弱，與對照組相比有非常顯著差異(P＜0.01);1.00 mmol/L LaCl35 d組CDK4表達(dá)最弱。P21免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對照組陽性細(xì)胞數(shù)很少，分布稀疏，染色淡;0.10 mmol/L LaCl3組細(xì)胞在培養(yǎng)1、3、5 d后，P21陽性細(xì)胞數(shù)有所增加，但與對照組比較無顯著性差異;而1.00 mmol/L LaCl3組細(xì)胞在培養(yǎng)1 d后P21陽性率即呈顯著性增加，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，增加的程度越高。見表3。

表1 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞生長及集落形成的影響(n=6，±s)

表1 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞生長及集落形成的影響(n=6，±s)

與對照組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與同組1 d、3 d比較:3)P ＜0.01;下表同

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表2 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞G0/G1期及S期比率的影響(n=6，± s，%)

表2 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞G0/G1期及S期比率的影響(n=6，± s，%)

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表3 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞CDK4和P21表達(dá)陽性率的影響(n=6，± s，%)

表3 不同劑量的LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞CDK4和P21表達(dá)陽性率的影響(n=6，± s，%)

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3 討論

眾多的研究表明細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的失控與腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展具有密切的關(guān)系。在細(xì)胞周期調(diào)控中G1/S的調(diào)節(jié)尤為重要。細(xì)胞一旦從G1期跨入S期，則不再依靠外來信息刺激而自動完成分裂過程。CDK4是細(xì)胞周期G1期重要的調(diào)控分子，CDK4蛋白能夠特異性地與細(xì)胞周期素(Cyclin D1)結(jié)合形成復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(Rb)蛋白磷酸化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子(E2F)的釋放，促使細(xì)胞完成DNA復(fù)制;P21是CDKs家族廣譜抑制劑，通過抑制CDK活性，誘導(dǎo)周期阻滯導(dǎo)致細(xì)胞分裂增殖停止，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長，為腫瘤抑制基因〔6～8〕。

稀土化合物對腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的研究較少見，劉玉榮等〔9〕研究表明，0.10、0.50 及1.00 mmol/L LaCl3使 SMMC-7721細(xì)胞Cyclin D1、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和CDK4蛋白表達(dá)下降，P16蛋白表達(dá)上升。在本實(shí)驗(yàn)中，0.10及1.00 mmol/L LaCl3對CBRH-7919細(xì)胞的生長和集落形成有明顯抑制作用 。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期各時(shí)相變化情況，結(jié)果顯示0.10、1.00 mmol/L LaCl3均可使G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著增加，而S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著下降，表明CBRH-7919細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期受阻，使CBRH-7919停留在G1期。表明LaCl3可通過下調(diào) G1期的 CDK4，重建了 CBRH-7919細(xì)胞周期失控的G1→S期檢查點(diǎn)，使CBRH-7919細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的過程受阻;而且，LaCl3可刺激 P21的表達(dá)，P21表達(dá)的增加使CBRH-7919細(xì)胞G1→S期的負(fù)調(diào)控路徑恢復(fù)，從而使CBRH-7919停留在G1期，流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。

綜上所述，LaCl3可通過下調(diào)CDK4和上調(diào)P21的蛋白表達(dá)，使CBRH-7919細(xì)胞阻滯在G1期，從而抑制CBRH-7919細(xì)胞的生長。

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9 劉玉榮，陳 東，姜文華，等.三氯化鑭對體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞的抑制作用〔J〕.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006;32(6):1029-33.