桔梗總皂苷對(duì)2型糖尿病大鼠肝臟并發(fā)癥的治療作用

欒海艷 歐 芹 趙曉蓮 王景濤 賈琳琳 齊淑芳 楊利敏 王偉群 王顯鋼

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 佳木斯大學(xué)兒童神經(jīng)康復(fù)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯 154007)

2型糖尿病(T2DM)的并發(fā)癥不僅包括腎臟、心臟、視網(wǎng)膜和神經(jīng)病變，肝臟亦為其長(zhǎng)期高血糖累及的靶器官之一。藥理學(xué)研究表明桔梗有顯著降糖和保肝作用〔1〕，但對(duì)DM肝臟并發(fā)癥的影響還未見(jiàn)報(bào)道。本文主要研究桔梗中重要有效部位桔梗總皂苷對(duì)DM肝臟并發(fā)癥的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組 純系Wistar大鼠48只，清潔級(jí)，體重180～220 g，雌雄各半，購(gòu)于佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。同室分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，自由進(jìn)水、飲食，12 h光照周期。所有大鼠正常飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為2組:正常對(duì)照組(8只)飼以正常飲食，DM組(40只)飼以高脂高糖飲食。喂養(yǎng)4 w后，DM組大鼠隔夜空腹尾靜脈一次性注射2%鏈脲佐菌素(STZ)25 mg/kg，正常對(duì)照組僅注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，DM組繼續(xù)飼以高脂高糖飲食4 w。9 w末DM組禁食18 h后，進(jìn)行空腹血糖(FPG)及肝功測(cè)定，F(xiàn)PG≥16.8 mmol/L、肝功異常為造模成功〔2〕。將造模成功的24只T2DM肝臟并發(fā)癥模型大鼠隨機(jī)分為2組:模型對(duì)照組(DM組)和桔梗總皂苷治療組(TSP組)，繼續(xù)高脂高糖飲食;喂飼基礎(chǔ)飼料的8只作為正常對(duì)照組(NC組)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方案 從第10周起TSP組給予桔梗總皂苷水溶液200 mg·kg－1·d－1灌胃，1次/d;NC組和DM組給予等體積蒸餾水灌胃。藥物干預(yù)12 w，整個(gè)實(shí)驗(yàn)共持續(xù)21 w。

1.2.2 留取標(biāo)本及檢測(cè)指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稱(chēng)量每只大鼠體重。禁食18 h后，乙醚麻醉，斷頭取血，檢測(cè)FPG、肝功等生化指標(biāo);迅速剖取肝臟，稱(chēng)量濕重，計(jì)算肝臟指數(shù);肝組織切成小塊，置于液氮中，凍透后轉(zhuǎn)入－80℃保存，待測(cè)肝組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1及Smad-4 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.3 檢測(cè)試劑 STZ為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;RT-PCR試劑盒、Trizol總RNA試劑、DNA marker均購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)兼制作;FPG、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2.4 檢測(cè)指標(biāo) ①FPG、ALT、AST檢測(cè)采用全自動(dòng)生化分析儀;②TGF-β1及Smad-4 mRNA的表達(dá)采用RT-PCR法檢測(cè)，以β-actin作為內(nèi)參照。引物序列如下:β-actin上游 5'TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA 3'，下游 5'TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3';TGF-β1上游 5'GAG CCC GAG GCG GAC TAC TAC 3'，下游 5'CAG GAA GGG TCG GTT CAT GTC 3';Smad-4上游5'TAA AGG TGA AGG GGA CGT GTG 3'，下游 5'CAT GGT GTG CAG GAC TTC ATC 3'。反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，BIO-BEST型凝膠成像分析系統(tǒng)拍攝并分析。結(jié)果以目的基因與β-actin吸光度的比值定量TGF-β1及Smad-4基因表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療后FPG、肝功及肝臟指數(shù)變化 與DM組相比，TSP組的FPG含量明顯降低(P＜0.01)，且已達(dá)正常標(biāo)準(zhǔn)，ALT明顯降低(P＜0.05)，AST含量明顯降低(P＜0.01)，肝臟指數(shù)明顯降低(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠治療后血糖、肝功及肝臟指數(shù)變化(± s，n=8)

表1 各組大鼠治療后血糖、肝功及肝臟指數(shù)變化(± s，n=8)

與NC組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與 DM 比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05;下表同

組別 FPG(mmol/L) ALT(U/L) AST(U/L)肝臟指數(shù)NC組9.43±2.17 63.17±16.07 97.50±9.50 2.25±0.21 DM組 19.20±4.231) 119.50±35.491)283.83±23.641) 4.39±0.281)TSP組14.05±2.121)3)92.00±16.522)4)202.67±19.571)3)3.10±0.101)3)

2.2 各組大鼠治療后肝組織中TGF-β1及Smad-4 mRNA表達(dá)的變化 與DM組相比，TSP組肝組織中TGF-β1mRNA的表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，Smad-4 mRNA表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 各組大鼠治療后肝組織中TGF-β1及Smad-4 mRNA表達(dá)的變化(± s，n=8)

表2 各組大鼠治療后肝組織中TGF-β1及Smad-4 mRNA表達(dá)的變化(± s，n=8)

組別 TGF-β1/β-actin Smad-4/β-actin NC組0.383±0.063 0.224±0.029 DM組 1.553±0.0961) 0.418±0.0431)TSP組 1.062±0.0781)3) 0.373±0.0211)4)

圖1 TGF-β1及Smad-4 mRNA的表達(dá)

2.3 TGF-β1與Smad-4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析 TGF-β1與Smad-4 mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.981，P＜0.01)。

3 討論

T2DM肝臟并發(fā)癥的發(fā)生與血糖長(zhǎng)期控制不良有密切關(guān)系，長(zhǎng)期發(fā)展可致脂肪肝、肝纖維化和肝癌等疾病。TGF-β1是目前研究最深入的與肝臟病變密切相關(guān)的細(xì)胞因子。TGF-β1可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、基質(zhì)產(chǎn)生和凋亡;在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，對(duì)模型形成和組織特異性分化起重要作用。研究證實(shí)在病理?xiàng)l件下，過(guò)量的 TGF-β1將導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrixc，ECM)的過(guò)度產(chǎn)生而誘發(fā)纖維化。TGF-β1在纖維化的起始和持續(xù)發(fā)展中起關(guān)鍵作用〔3〕，它對(duì)組織細(xì)胞的作用是通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)完成的。在該系統(tǒng)中除了TGF-β1及其受體外還有許多蛋白特別是Smads蛋白的參與，而Smad-4是哺乳動(dòng)物中目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)Co-Smads，它的作用不同于Smads家族的其他成員，不僅是TGF-β/activin信號(hào)通路中必需的信號(hào)中轉(zhuǎn)分子，而且可以與所有活化的受體調(diào)節(jié)型Smads蛋白結(jié)合，作為共同遞質(zhì)和磷酸化的受體調(diào)節(jié)型Smads相結(jié)合形成異低聚體復(fù)合物后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中激活轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。

本研究結(jié)果表明，桔梗總皂苷能通過(guò)上述途徑改善和減緩肝臟并發(fā)癥進(jìn)程。當(dāng)然桔梗總皂苷還有許多有待發(fā)掘的作用，作為傳統(tǒng)中藥其應(yīng)用前景廣闊。

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，Ⅰ部〔S〕.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:196.

2 胡愛(ài)民，肖鳳英，鄭 云.2型糖尿病并脂肪肝實(shí)驗(yàn)性大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)〔J〕.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2006;14(3):156-9.

3 Border WA，Noble NA.Transforming growth factor beta in tissue fibrosis〔J〕.N Engl J Med，1994;331(19):1286-92.