桔梗總皂苷對2型糖尿病大鼠肝臟并發癥的治療作用

欒海艷 歐 芹 趙曉蓮 王景濤 賈琳琳 齊淑芳 楊利敏 王偉群 王顯鋼

(佳木斯大學基礎醫學院 佳木斯大學兒童神經康復實驗室，黑龍江 佳木斯 154007)

2型糖尿病(T2DM)的并發癥不僅包括腎臟、心臟、視網膜和神經病變，肝臟亦為其長期高血糖累及的靶器官之一。藥理學研究表明桔梗有顯著降糖和保肝作用〔1〕，但對DM肝臟并發癥的影響還未見報道。本文主要研究桔梗中重要有效部位桔梗總皂苷對DM肝臟并發癥的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型及分組 純系Wistar大鼠48只，清潔級，體重180～220 g，雌雄各半，購于佳木斯大學實驗動物中心。同室分籠飼養于標準環境，自由進水、飲食，12 h光照周期。所有大鼠正常飼養1 w后，隨機分為2組:正常對照組(8只)飼以正常飲食，DM組(40只)飼以高脂高糖飲食。喂養4 w后，DM組大鼠隔夜空腹尾靜脈一次性注射2%鏈脲佐菌素(STZ)25 mg/kg，正常對照組僅注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，DM組繼續飼以高脂高糖飲食4 w。9 w末DM組禁食18 h后，進行空腹血糖(FPG)及肝功測定，FPG≥16.8 mmol/L、肝功異常為造模成功〔2〕。將造模成功的24只T2DM肝臟并發癥模型大鼠隨機分為2組:模型對照組(DM組)和桔梗總皂苷治療組(TSP組)，繼續高脂高糖飲食;喂飼基礎飼料的8只作為正常對照組(NC組)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方案 從第10周起TSP組給予桔梗總皂苷水溶液200 mg·kg－1·d－1灌胃，1次/d;NC組和DM組給予等體積蒸餾水灌胃。藥物干預12 w，整個實驗共持續21 w。

1.2.2 留取標本及檢測指標 實驗結束后，稱量每只大鼠體重。禁食18 h后，乙醚麻醉，斷頭取血，檢測FPG、肝功等生化指標;迅速剖取肝臟，稱量濕重，計算肝臟指數;肝組織切成小塊，置于液氮中，凍透后轉入－80℃保存，待測肝組織中轉化生長因子(TGF)-β1及Smad-4 mRNA的表達水平。

1.2.3 檢測試劑 STZ為美國Sigma公司產品;RT-PCR試劑盒、Trizol總RNA試劑、DNA marker均購于南京凱基生物科技發展有限公司;引物由北京奧科生物技術有限公司設計兼制作;FPG、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2.4 檢測指標 ①FPG、ALT、AST檢測采用全自動生化分析儀;②TGF-β1及Smad-4 mRNA的表達采用RT-PCR法檢測，以β-actin作為內參照。引物序列如下:β-actin上游 5'TCC TCC CTG GAG AAG AGC TA 3'，下游 5'TCA GGA GGA GCA ATG ATC TTG 3';TGF-β1上游 5'GAG CCC GAG GCG GAC TAC TAC 3'，下游 5'CAG GAA GGG TCG GTT CAT GTC 3';Smad-4上游5'TAA AGG TGA AGG GGA CGT GTG 3'，下游 5'CAT GGT GTG CAG GAC TTC ATC 3'。反應產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，BIO-BEST型凝膠成像分析系統拍攝并分析。結果以目的基因與β-actin吸光度的比值定量TGF-β1及Smad-4基因表達水平。

2 結果

2.1 各組大鼠治療后FPG、肝功及肝臟指數變化 與DM組相比，TSP組的FPG含量明顯降低(P＜0.01)，且已達正常標準，ALT明顯降低(P＜0.05)，AST含量明顯降低(P＜0.01)，肝臟指數明顯降低(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠治療后血糖、肝功及肝臟指數變化(± s，n=8)

表1 各組大鼠治療后血糖、肝功及肝臟指數變化(± s，n=8)

與NC組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與 DM 比較:3)P＜0.01，4)P＜0.05;下表同

組別 FPG(mmol/L) ALT(U/L) AST(U/L)肝臟指數NC組9.43±2.17 63.17±16.07 97.50±9.50 2.25±0.21 DM組 19.20±4.231) 119.50±35.491)283.83±23.641) 4.39±0.281)TSP組14.05±2.121)3)92.00±16.522)4)202.67±19.571)3)3.10±0.101)3)

2.2 各組大鼠治療后肝組織中TGF-β1及Smad-4 mRNA表達的變化 與DM組相比，TSP組肝組織中TGF-β1mRNA的表達明顯減少(P＜0.01)，Smad-4 mRNA表達明顯減少(P＜0.05)。見表2，圖1。

表2 各組大鼠治療后肝組織中TGF-β1及Smad-4 mRNA表達的變化(± s，n=8)

表2 各組大鼠治療后肝組織中TGF-β1及Smad-4 mRNA表達的變化(± s，n=8)

組別 TGF-β1/β-actin Smad-4/β-actin NC組0.383±0.063 0.224±0.029 DM組 1.553±0.0961) 0.418±0.0431)TSP組 1.062±0.0781)3) 0.373±0.0211)4)

圖1 TGF-β1及Smad-4 mRNA的表達

2.3 TGF-β1與Smad-4 mRNA表達的相關性分析 TGF-β1與Smad-4 mRNA表達呈顯著正相關(r=0.981，P＜0.01)。

3 討論

T2DM肝臟并發癥的發生與血糖長期控制不良有密切關系，長期發展可致脂肪肝、肝纖維化和肝癌等疾病。TGF-β1是目前研究最深入的與肝臟病變密切相關的細胞因子。TGF-β1可調節細胞的生長、分化、基質產生和凋亡;在胚胎生長發育過程中，對模型形成和組織特異性分化起重要作用。研究證實在病理條件下，過量的 TGF-β1將導致細胞外基質(extracellularmatrixc，ECM)的過度產生而誘發纖維化。TGF-β1在纖維化的起始和持續發展中起關鍵作用〔3〕，它對組織細胞的作用是通過復雜的信號傳導系統來完成的。在該系統中除了TGF-β1及其受體外還有許多蛋白特別是Smads蛋白的參與，而Smad-4是哺乳動物中目前發現的唯一一個Co-Smads，它的作用不同于Smads家族的其他成員，不僅是TGF-β/activin信號通路中必需的信號中轉分子，而且可以與所有活化的受體調節型Smads蛋白結合，作為共同遞質和磷酸化的受體調節型Smads相結合形成異低聚體復合物后轉運至細胞核中激活轉錄應答。

本研究結果表明，桔梗總皂苷能通過上述途徑改善和減緩肝臟并發癥進程。當然桔梗總皂苷還有許多有待發掘的作用，作為傳統中藥其應用前景廣闊。

1 國家藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部〔S〕.北京:化學工業出版社，2005:196.

2 胡愛民，肖鳳英，鄭 云.2型糖尿病并脂肪肝實驗性大鼠模型的建立及評價〔J〕.中國中西醫結合消化雜志，2006;14(3):156-9.

3 Border WA，Noble NA.Transforming growth factor beta in tissue fibrosis〔J〕.N Engl J Med，1994;331(19):1286-92.