心脈隆注射液HPLC指紋圖譜建立方法的研究

焦春香， 張成桂， 劉光明， 李樹楠

(大理學院藥學院，云南大理671000)

心脈隆注射液是一種從美洲大蠊Periplanta americana linneus提取物中精制而成的中藥靜脈注射制劑，對充血性心力衰竭、肺心病、右心衰臨床療效良好，有著起效快、療效確切、安全可靠等優點。心脈隆注射液中含有復合核苷類和結合氨基酸等多種化合物，其中復合核苷類是主要有效成分，結合氨基酸可使復合核苷類的藥效作用增強［1-2］。本實驗采用離子色譜去除結合氨基酸部分及其他雜質，盡量純化復合核苷類，再通過RP-HPLC建立心脈隆注射液指紋圖譜。

1 儀器與試藥

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2004，國家藥典委員會);Agilent 1100液相色譜儀，DVD-二極管陣列檢測器，Agilent LC色譜工作站;甲醇(色譜純)，重蒸水(實驗室自制)，冰乙酸、乙酸鈉均為分析純，強堿性陰離子交換樹脂717(粒度0．3-1．2 mm)購自安徽三星樹脂科技有限公司。

美洲大蠊藥材5批(1昆明養殖場，2008;2昆明養殖場，2008;3賓川養殖場，2007;4彌渡養殖場，2007;5彌渡養殖場2006)購于各養殖基地。心脈隆注射劑10批(李樹楠教授提供，批號20050412、20050610、 20050401、 20050405、 20050404、20050607、200703、200606、20050603、20060604。依次編號為1～10。);尿嘧啶對照品購自sigma公司(貨號U0750，純度大于99%)。

2 試驗方法與系統適應性

2．1 供試品制備 注射液供試品的制備:強堿性陰離子交換樹脂717經過處理，以其水懸液裝柱，層析柱內徑1．5 cm，樹脂床高2．0 cm，表面覆蓋一濾紙圓片［3］。用蒸餾水洗脫后，再加 0．5 mol/L NaOH溶液約5 mL，待流出后用蒸餾水10 mL洗脫，備用。精密量取供試樣品1．0 mL，加0．5 mol/L NaOH 溶液0．25 mL，調節pH至9加于柱上，待流出后用蒸餾水10 mL洗脫。加0．2 mol/L乙酸溶液;待淺色洗脫前緣向下移動到樹脂柱下端約0．4 cm處時開始收集洗脫液，至其體積為22 mL時停止，加入1 mol/L NaOH溶液，定容至25 mL，混勻，即為供試品檢測液。用0．45μm的微孔濾膜濾過。

美洲大蠊藥材供試品溶液的制備:稱取25 g美洲大蠊干粉，200mL 95%乙醇80℃回流1 h，過濾;取濾液100 mL，60℃減壓濃縮至干，所得浸膏加50 mL蒸餾水溫溶，過濾。濾液應澄明清亮。精密量取5．0 mL過濾液經強堿性陰離子交換樹脂717處理，方法同上。

對照品溶液的制備:精密稱取預置于干燥器中的標準品適量，用50%甲醇水溶液配成0．25 mg/mL溶液，使用時將其用水準確稀釋為0．05 mg/mL溶液。

2．2 色譜條件 流動相A:0．02% 乙酸緩沖溶液(pH=5．0)，流動相 B:100%甲醇;Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4．6 mm ×150 mm，5 μm);檢測波長254 nm;柱溫30℃;體積流量0．8 mL/min;運行時間15 min;進樣量10μL。梯度程序:0 min，95%A+5%B;3 min，90%A+10%B;6 min，85%A+15%B;9 min，80%A+20%B;14 min，85%A+15%B;15 min，95%A+5%B。在上述色譜條件下，理論板數不低于10 000。

2．3 精密度試驗 取供試品溶液(批號20050412)，在所建立的測定條件下，連續進樣5次采用夾角余弦法對全圖譜進行計算，5次進樣的色譜圖其相似度均為0．99以上，同時以尿嘧啶色譜峰保留時間及峰面積為參照，5次共有峰的相對保留時間和相對峰面積比值基本一致，相對保留時間 RSD低于1%;峰面積占總峰面積1%以上的各共有峰相對峰面積RSD低于3%，顯示進樣的精密度良好。符合指紋圖譜研究技術的要求［4-5］。

2．4 穩定性試驗 取供試品溶液(批號20050412)，分別在48 h內不同時間段進樣9次，按所建立的測定條件進行檢測，采用上述方法對所得結果進行計算，其相似度均為0．95以上，同時以尿嘧啶色譜峰保留時間及峰面積為參照，共有峰的相對保留時間和相對峰面積比值基本一致。結果表明在48 h內，心脈隆注射液的色譜指紋圖譜基本穩定，其RSD均低于3%，符合指紋圖譜研究技術的要求［4-5］。

2．5 重現性試驗［6］取 同 一 批 注 射 液 (批 號20050412)10份，精密量取，按2．1項下制備，按2．2項下條件檢測，記錄5份樣品色譜峰的保留時間及峰面積值。采用夾角余弦法對10次測定結果的全圖譜進行相似度計算，其相似度均為0．94以上，同時以尿嘧啶色譜峰保留時間及峰面積為參照，共有峰的相對保留時間的RSD低于1．8%;相對峰面積的RSD值為4．3%，結果表明方法重現性良好。

3 結果與分析［5，7］

3．1 共有峰確定 測定10批心脈隆注射液，指紋圖譜見圖1。比較其色譜圖，確定共有峰為12個，峰面積占總峰面積0．5%以上的共有峰有8個。以尿嘧啶為參照物，尿嘧啶色譜峰(S峰)的保留時間和峰面積為1，分別計算其余共有峰的相對保留時間和峰面積積分值比值(見表1、2)。測定各峰相對保留時間RSD ＜3．0%，共有指紋峰的峰面積之和占總峰面積的比值大于95%。

表1 心脈隆注射液共有指紋峰相對保留時間(n=10)Tab．1 Reletive tR of common fingerprint peaks of Xinmailong Injection(n=10)

表2 心脈隆注射液的指紋圖譜共有峰相對峰面積(n=10)Tab．2 Reletive of copossessing fingerprint peak area of Xinmailong Injection(n=10)

圖1 10批心脈隆注射液的指紋圖譜和共有模式(R)Fig．1 Themathed chromatogram and fingerprint common pattern(R)of 10 batches of Xinmaitong Injection

根據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求(暫行)》［4］中要求，單峰面積占總峰面積大于或等于20%的共有峰峰3(S峰)，相對峰面積RSD小于±20%;單峰面積占總峰面積大于或等于10%，而小于20%的共有峰峰4、峰6，RSD分別為14%，12%，均小于±25%;單峰面積占總峰面積小于10%，而大于等于5%的共有峰峰5、峰7，RSD分別為15%，22%，均小于±30%;峰面積比值小于5%的共有峰不作要求。

3．2 指紋圖譜相似度分析 指紋圖譜相似度測試的方法有很多，這里選用了相關系數法和夾角余弦法對色譜峰峰高、峰面積和全圖譜的相似度進行了評價［7］，以1號注射液樣品指紋圖譜為參照，結果見表3。無論是峰面積、峰高、全圖譜相似度都達到0．98以上，說明不同批次心脈隆注射液的色譜圖相關性良好。

3．3 藥材與注射液的相關性 分別取美洲大蠊藥材、心脈隆注射液各5批，按上法操作后進樣測定。以1批藥材指紋圖譜為參照，結果見表4。不同養殖場的美洲大蠊藥材不是很穩定，與注射劑的相關性不是很好。如表4相似度分析，雖然峰面積和峰高相似達到0．90以上，但是夾角余弦法分析全圖譜的相似度不是很高，一方面是不同批次的美洲大蠊藥材之間相似度低于0．90，另一方面藥材與注射劑之間相似度也低于0．90。

表3 10批心脈隆注射液相似度分析Tab．3 The correalation of 10 batches of Xinmaitong Injection

表4 5批藥材與5批注射劑相似度分析Tab．4 The correalation of 5 batches of between Xinmailong Injection and medicinalmaterials

4 討論

心脈隆注射液成分復雜，從藥材和制劑制備供試品液，應盡可能保留核苷類成分，去除制劑的添加成分和污染反相色譜柱的部分。根據核苷堿基的性質，擬采用離子交換色譜法制備供試品溶液。王利春等采用陽離子交換樹脂純化美洲大蠊藥材中核苷類物質［8］。因核苷堿基具有離解基團如NH-CO或咪唑基中的-NH-，具有弱堿性;在pH值約9．0時，核苷堿基可交換吸附在強堿性陰離子交換柱上，用乙酸洗脫核苷堿基，從而達到純化目的。故本實驗選用強堿性陰離子交換樹脂。該樣品純化方法可靠，連續10次純化的樣品圖譜相似度可達到0．94以上，共有峰的相對保留時間的RSD低于1．8;相對峰面積的RSD值為4．3%。色譜條件采用甲醇-磷酸鹽溶液為流動相，分離效果較好、各峰分離度較大、基線平穩、保留時間適中。

參照物首選有標準品提供的君藥中主要有效成分，其次是其它有效成分，再次是大量存在的指標成分，最后才選一定的內標作為參照物。選擇有效成分的優點是可以方便地通過峰值比，控制相對的量比，為以后成分和藥效相關性提供一定依據［5］。故本實驗選取了心脈隆注射液中含有量比較高的尿嘧啶為參照物。

中藥現代化要求中藥注射劑都必須有指紋圖譜作為質量標準。心脈隆注射液于2006年取得新藥證書，必須建立指紋圖譜。根據其有效成分，本實驗做了一定的探索，初步建立的指紋圖譜符合《中藥注射劑指紋圖譜的技術要求(暫行)》，但也發現美洲大蠊藥材的質量存在一定問題。

［1］李樹楠，胡 忠．治療心血管疾病的藥用制劑:中國，94118839．6［P］．1996-06-12．

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［4］國家藥品監督管理局．國藥管注［2000］348號:關于印發《中藥注射劑指紋圖譜的技術要求(暫行)》的通知［S］．2000．

［5］曹 進，饒 毅，沈 群，等．中藥注射劑指紋圖譜分析［J］．世界科學技術—中藥現代化，2001，3(4):20-25．

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［7］程翼宇，陳閩軍，吳永江．化學指紋圖譜的相似性測度及其評價方法［J］．化學學報，2002，60(11):2017-2021．

［8］王利春，孔繁貴，廖 軍，等．一種美洲大蠊藥材及其提取物指紋圖譜質量測定方法:中國，2008101167730［P］．2008-12-10．