荔枝草提取物對大鼠肝線粒體損傷的保護作用

師梅梅， 楊建雄， 任 維

(陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安710062)

荔枝草為唇形科鼠尾草屬植物雪見草Salvia plebeia R．Br．的全草，二年生直立草本，性平，味辛，無毒，在我國和印度分布非常廣泛。國內(nèi)外研究表明，荔枝草的化學(xué)成分主要是黃酮類、二萜類和木酚素類化合物［1-2］，具有止咳平喘、祛痰及抗組胺、抑菌及抗氧化作用［3-4］。但對其在保護線粒體方面的作用尚未見報道，本實驗用多種方法研究荔枝草提取物對大鼠肝線粒體損傷的保護作用，為探索荔枝草藥理作用的機制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 動物與材料 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±2)g，由陜西省中醫(yī)研究院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號:陜醫(yī)動字008-01/025。2，4-二硝基苯肼(DNPH)、抗壞血酸(Vc)、沒食子酸、蘆丁、福林酚試劑、水飽和酚，購自美國Sigma公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。荔枝草全草購買于安徽省中藥材市場，經(jīng)鑒定為 Salvia plebeia R．Br．，保存在4°C冰箱內(nèi)備用。

1．2 荔枝草提取物的制備 準(zhǔn)確稱取已干燥的荔枝草全草50 g，加10倍量體積70%的乙醇80～82°C回流提取1．0 h，重復(fù)3次，合并所得提取液，60°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后依次用等體積的石油醚和乙酸乙酯萃取4次，棄醚相，將所得到的水相(SE1)和乙酸乙酯相(SE2)部分經(jīng)減壓濃縮后置于60°C烘箱烘干至恒質(zhì)量。

1．3 荔枝草提取物中有關(guān)成分的分析 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系吸光光度法測定總黃酮;以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林試劑法測定總酚;以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定多糖。

1．4 大鼠肝線粒體的制備 參照文獻［5］方法進行，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，通過Lowry法來測量線粒體懸浮液中蛋白質(zhì)。

1．5 線粒體損傷模型的建立 在本實驗中，主要采取 Fe2+-Vc體系［6］和 Fe2+-H2O2體系［7］產(chǎn)生·OH，·OH可以使線粒體膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，損害線粒體膜的通透性，造成ATP合成功能障礙。

1．6 對肝線粒體脂質(zhì)過氧化的影響 根據(jù)文獻［8］稍作修改，1．0 mL的肝線粒體懸浮液(蛋白含有量為0．50 mg/mL)中加入1．0 mL不同質(zhì)量濃度的 SE 溶液(0．05，0．10，0．20，0．30，0．40，0．50 mg/mL)，混勻后加入6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液100μL和60 mmol/L的過氧化氫溶液40μL，37°C孵育1．0 h，然后加入 15%(w/v)的 TCA 溶液 1．0 mL，搖勻后加入0．67%(w/v)的 TBA 溶液 1．0 mL，搖勻，沸水浴中15 min，冷卻后3 000 r/min離心10 min，取上清液測 A532nm，空白不加 TBA，對照不加樣。

1．7 對肝線粒體腫脹度的影響 3．0 mL的肝線粒體懸浮液(蛋白質(zhì)含有量為1．0 mg/mL)中加入0．40 mL不同濃度的 SE 溶液(0．05，0．10，0．20 mg/mL)混勻后，再加入0．50 mmol/L的硫酸亞鐵溶液0．40 mL和0．50 mmol/L 的 Vc溶液 0．40 mL 激發(fā)反應(yīng)，測定不同時間的A520nm［9］。

1．8 對肝線粒體中蛋白質(zhì)羰基水平的影響 參照文獻［6］的方法稍作修改，1．5 mL的肝線粒體懸浮液(蛋白含有量為0．70 mg/mL)中加入1．0 mL不同濃度的SE溶液，搖勻，依次加入0．50 mmol/L的FeSO4溶液 0．20 mL和 0．50 mmol/L的 Vc溶液0．20 mL，混勻后加入10 mmol/L的DNPH溶液(溶于2．0 mol/L的鹽酸中)0．20 mL，置于黑暗中反應(yīng)1．0 h，每15 min渦旋1次。反應(yīng)完畢后，加入20%的TCA 0．20 mL，冰浴10 min來沉淀蛋白質(zhì)腙衍生物，4．0 ℃下12 000 r/min 離心10min，棄上清，所得到的沉淀用1．5 mL乙醇和乙酸乙酯混合物(體積比為3∶1)洗滌3次，最后的沉淀溶于3%的SDS溶液(溶于pH6．8的磷酸鈉緩沖液)中，在37°C孵育15 min后測A370nm。空白對照不加DNPH溶液，用等體積的鹽酸代替。羰基濃度用摩爾消光系數(shù)ε=22 000 L/(mol·cm)來計算。含羰基量用每1 mg蛋白中含有多少nmol的羰基來表示。

1．9 對線粒體中ATP酶活性的影響 線粒體損傷用上述的Fe2+-Vc來誘導(dǎo)，ATP酶的活性用每毫克蛋白質(zhì)每小時中新生成的無機磷的量(μmol)來表示［10］。

1．10 對線粒體中O2－·生成的影響 根據(jù)文獻［11］稍作修改，0．20 mL的肝線粒體懸浮液(蛋白含有量約為0．50 mg/mL)中加入1．0 mL不同濃度的SE溶液，混勻后加入混合溶液(100μmol/L NBT，0．25 mol/L 蔗糖，10 mmol/L Tris – HCl(pH 7．4)和2．0 mmol/L 磷酸鉀)2．6 mL，室溫下孵育1．0 h，然后加入 5．0 mmol/L 的琥珀酸鹽溶液 0．20 mL，測A595nm，樣品對 O2－·的清除率 =(1－A樣/A對照)×100%。

2 結(jié)果與討論

2．1 提取物得率及有關(guān)成分分析 實驗所得SE1和 SE2 分別為4．741 和4．675 g，得率分別為9．48%和9．35%，SE1中總黃酮、總酚和多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為21．59%、0．29% 和 20．06%，SE2 中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92．09%。

2．2 荔枝草提取物對脂質(zhì)過氧化的影響 自由基使線粒體、微粒體和溶酶體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的膜上多聚不飽和脂肪酸過氧化，使線粒體、微粒體功能障礙，導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)甚至破裂、死亡或凋亡。FeSO4與H2O2誘導(dǎo)肝線粒體膜脂質(zhì)過氧化物MDA生成，可作為·OH誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化的特征。

實驗結(jié)果見表1，在所檢測濃度范圍內(nèi)，SE均表現(xiàn)出較強的抑制脂質(zhì)過氧化的能力，且呈顯著的劑量依賴性關(guān)系，在0．10～0．40 mg/mL范圍內(nèi)，SE2的抑制率略高于SE1，但在較高質(zhì)量濃度(0．50 mg/mL)時，兩者抑制脂質(zhì)過氧化的能力相當(dāng)，其抑制率分別為96．25%和95．12%。

2．3 荔枝草提取物對線粒體腫脹度的影響 據(jù)文獻報道，F(xiàn)e2+-Vc誘導(dǎo)鼠肝線粒體膨脹的原因是由于膜脂質(zhì)過氧化作用，使膜構(gòu)造改變，膜的屏障功能喪失，膜內(nèi)外離子交換發(fā)生障礙。線粒體氧化損傷后發(fā)生腫脹，表現(xiàn)為其懸液渾濁度下降，在A520nm降低，抑制腫脹，則使其A520nm趨于穩(wěn)定。

由圖1可以看出，隨著時間的延長各組在A520nm下降，說明線粒體膜被氧化損傷發(fā)生了腫脹，其中正常組變化不大(9．69%)，陰性對照組下降幅度最大(32．44%)，加樣組下降趨勢減緩，說明SE可以抑制·OH所導(dǎo)致的氧化損傷，線粒體腫脹減輕，而且呈明顯的量效關(guān)系。在所檢測的時間范圍內(nèi)，SE1在0．10和0．20 mg/mL時的變化分別為22．12%和 17．47%，SE2 在 0．10 和0．20 mg/mL時的變化分別為20．15%和16．67%，由此可知，SE2抑制線粒體腫脹的能力略好于SE1，并且隨著濃度的增大，兩者的抑制能力逐漸增強。

表1 SE抑制脂質(zhì)過氧化的能力( ± s，n=3)Tab．1 Liver m itochondria lipid peroxidation assay of SE( ± s，n=3)

表1 SE抑制脂質(zhì)過氧化的能力( ± s，n=3)Tab．1 Liver m itochondria lipid peroxidation assay of SE( ± s，n=3)

樣品濃度/(mg/mL) SE1抑制率/% SE2抑制率/%0．05 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 31．37 ±4．28 50．51 ±6．72 66．40 ±2．25 66．67 ±3．47 81．67 ±0．81 95．12 ±0．82 45．5 ±3．16 58．75 ±4．25 76．75 ±1．26 79．75 ±2．49 83．25 ±3．61 96．25 ±1．52

圖1 SE對線粒體腫脹度的影響( ± s，n=3)Fig．1 Effects of SE on m itochondrialmembrane swelling( ± s，n=3)

2．4 荔枝草提取物對蛋白質(zhì)羰基水平的影響 蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生是蛋白質(zhì)分子被自由基氧化修飾的一個重要標(biāo)記，由于這一特征具有普遍性，因而通過測定羰基可判斷蛋白質(zhì)是否被氧化損傷，從而評價SE對線粒體的抗氧化活性。

從表2可以看出，經(jīng)Fe2+-Vc誘導(dǎo)后，大鼠肝線粒體中蛋白質(zhì)羰基含有量明顯增多，說明線粒體受到了氧化損傷，加入SE后，蛋白質(zhì)羰基含有量下降，且呈現(xiàn)濃度依賴性趨勢，即受試物濃度越高，蛋白質(zhì)羰基含有量越低。相比較而言，SE2降低蛋白質(zhì)羰基的能力明顯強于SE1，SE2在0．20 mg/mL時可使蛋白質(zhì)羰基含有量下降為8．23 nmol/mg，而SE1在該濃度時只能使其下降為28．23 nmol/mg，SE2在0．40 mg/mL時即可使蛋白質(zhì)羰基水平恢復(fù)至接近正常水平，SE1則需在1．0 mg/mL時才能達到類似效果。

表2 SE對蛋白質(zhì)羰基水平的影響( ± s，n=3)Tab．2 Effects of SE on mitochondrial protein carbonyl groups( ± s，n=3)

表2 SE對蛋白質(zhì)羰基水平的影響( ± s，n=3)Tab．2 Effects of SE on mitochondrial protein carbonyl groups( ± s，n=3)

樣品名稱 SE加入量/(mg/mL) 蛋白質(zhì)羰基/(nmol/mg)陰性對照SE1 SE2正常—0．20 0．40 0．60 0．80 1．00 0．05 0．10 0．15 0．20 0．30 0．40—34．81 ±3．23 28．23 ±1．84 23．20 ±1．26 13．33 ±0．89 9．96 ±1．45 6．96 ±0．54 28．23 ±1．54 21．04 ±2．14 11．86 ±1．03 8．23 ±0．94 7．09 ±0．35 6．41 ±0．42 3．26 ±0．31

2．5 荔枝草提取物對ATP酶活性的影響 肝臟是能量代謝的重要器官，含有豐富的線粒體，而線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的基地和能量供應(yīng)的場所，細(xì)胞生命活動約95%的能量來自線粒體。ATP是機體內(nèi)各種生理活動最直接的供能物質(zhì)，它的產(chǎn)生依賴于ATP酶的活性。ATP酶是生物體內(nèi)廣泛存在的一種重要的膜酶，其主要參與細(xì)胞內(nèi)外陽離子的轉(zhuǎn)運及能量的供應(yīng)，對維持細(xì)胞的正常功能十分重要。

實驗結(jié)果(見表3)表明，經(jīng)Fe2+-Vc處理后，線粒體ATP酶活性下降，每毫克蛋白質(zhì)每小時新生成的無機磷量，由正常時的6．03μmol下降到3．01 μmol，約下降了50%，加入荔枝草提取物進行保護后，ATP酶活性顯著增強，且在所檢測濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，即受試物的濃度越高，酶活性越強。SE1在1．0 mg/mL時可使ATP酶的活性恢復(fù)到接近正常水平，而SE2在0．40 mg/mL時就可達到相似的效果，這充分說明SE2在線粒體受損時對ATP酶活性影響較大，也就是說其對線粒體損傷的保護能力要強于SE1。

2．6 荔枝草提取物對O2－·生成的影響 線粒體經(jīng)Fe2+-Vc誘導(dǎo)受到損傷時，會產(chǎn)生自由基，主要是O2－·，本實驗測定 SE對線粒體損傷時產(chǎn)生的O2－·有無清除作用。結(jié)果如圖2所示:在0～0．50 mg/mL范圍內(nèi)，SE對O2－·的清除能力隨著濃度的升高而增強，且SE2清除能力較SE1強，SE2在0．50 mg/mL時清除率可達80．06%，半數(shù)清除濃度IC50為0．29 mg/mL，而SE1在同濃度時清除率只有68．65%，半數(shù)清除濃度 IC50為 0．36 mg/mL。

表3 SE對ATP酶活性的影響( ± s，n=3)Tab．3 Effects of SE on mitochondrial ATPase activity( ± s，n=3)

表3 SE對ATP酶活性的影響( ± s，n=3)Tab．3 Effects of SE on mitochondrial ATPase activity( ± s，n=3)

樣品名稱 SE加入量/(mg/mL) ATP酶活性/μmol陰性對照SE1 SE2正常—0．20 0．40 0．60 0．80 1．00 0．05 0．10 0．20 0．30 0．40—3．01 ±0．49 3．99 ±0．86 4．50 ±1．02 5．28 ±1．63 5．60 ±1．42 5．66 ±2．51 3．47 ±1．71 4．31 ±1．62 4．71 ±1．54 5．28 ±2．69 5．90 ±2．77 6．03 ±1．26

圖2 SE對線粒體超氧自由基生成的影響( ± s，n=3)Fig．2 Effects of SE on mitochondrial superoxide anion generation( ± s，n=3)

3 結(jié)論

實驗結(jié)果表明，SE可以有效地抑制線粒體損傷時的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和線粒體膨脹，降低蛋白質(zhì)羰基的量，恢復(fù)ATP酶的活性，清除線粒體中產(chǎn)生的O2－·，并且呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。SE2和SE1抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和線粒體膨脹的能力均隨著濃度的增大而增強，相比較而言，SE2的作用稍強于SE1;在所檢測濃度范圍內(nèi)，SE2對受損線粒體中蛋白質(zhì)羰基含量和ATP酶活性的影響比SE1要顯著的多;SE1和SE2對線粒體中產(chǎn)生的O2－·都有很強的清除作用，其半數(shù)清除濃度分別為0．36和0．29 mg/mL。SE2的效果較好，可能是該提取物中黃酮含有量較高所致。這一結(jié)論為其在生物體內(nèi)藥理作用的機制提供一定的依據(jù)，同時也為其作為抗氧化藥物或食品抗氧化劑提供參考。

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