六神丸及其組分雄黃、蟾酥與無機(jī)砷急性毒性比較

梁世霞， 余麗梅， 苗加偉， 吳 芹， 劉 杰*

(1．遵義醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室/貴州省基礎(chǔ)藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563003;2．遵義醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563003)

六神丸是中國傳統(tǒng)中藥的四大名藥之一，在中國的藥用史長達(dá)300多年，組方中含有蟾酥、雄黃等6味名貴中藥材;對咽喉腫痛、口舌糜爛、牙痛、流行性腮腺炎等的治療有獨(dú)到的功效［1］，近年來也被用于治療流行性感冒、帶狀皰疹、尋常疣和腫瘤等多種疾病［2］。其組方中的雄黃和蟾酥都是有毒中藥材，大量或長期攝入會引起中毒［3-4］。六神丸引起的不良反應(yīng)報道也有不少，不合理用藥可引起患者死亡，尤其是新生兒及嬰幼兒死亡事件時有發(fā)生。六神丸究竟有多毒?六神丸含雄黃，其毒性是否等同于一般的無機(jī)砷化物?六神丸的毒性是蟾酥還是雄黃引起的?本實(shí)驗(yàn)將六神丸、雄黃和蟾酥的急性毒性與無機(jī)砷進(jìn)行比較，為六神丸的臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1．1 材料 六神丸、雄黃(＞90%As4S4)和蟾酥均購自蘇州雷允上有限公司;砷酸氫二鈉，美國Sigma公司;PCR純化試劑盒，上海華舜生物技術(shù)有限公司批號2006A;逆轉(zhuǎn)試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司批號DRR037A;Trizol寶生物工程(大連)有限公司 批號D91084;SYBR Green熒光染料(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA);硝酸(優(yōu)級純)批號T20090902國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，所有試劑均分析純等級。

1．2 動物 昆明種成年小鼠購自重慶市實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)檢中心，清潔級，18～22 g，雌雄各半，合格證:NO．0002438，飼養(yǎng)于(22±1)℃，(50±2)%的相對濕度，日晝12 h交替的動物室。

1．3 主要儀器 TU-180紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;多功能梯度PCR儀，型號:22331;冷凍離心機(jī)，型號:5417R;冷凍離心機(jī)，型號:X-15R;實(shí)時熒光定量PCR儀，美國，型號:Icyclery IQ;Leica QwinV3圖像分析系統(tǒng)，德國Leica公司;消化用電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，型號:101B-2上海電熱儀器總廠;雙道原子熒光光度計(jì)，北京科創(chuàng)海光儀器有限公司，型號:NO．L1d049。

2 方法

2．1 分組及給藥 昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，每組6只，分別為正常對照組、六神丸組(200 mg/kg，含雄黃或蟾酥 26．6 mg/kg，40 倍的臨床日用藥量)、雄黃組(30 mg/kg，相當(dāng)于As 21 mg/kg)、蟾酥組(30 mg/kg)、Na2HAsO4·7H2O 組(As5+，44 mg/kg，相當(dāng)于 As10．5 mg/kg)，分別灌胃給予(0．2 mL/10 g)以上各藥物，正常對照組給予等體積的生理鹽水。給藥后觀察小鼠的一般狀況，8 h后斷頸處死小鼠取材。

2．2 血清ALT、AST、BUN測定 收集血液離心取血清，自動分析儀定量檢測血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平，評估肝、腎功能。

2．3 組織中砷含有量檢測 取肝、腎和心組織，稱質(zhì)量100 ～200 mg，加入5 mL 濃硝酸，170 ℃、2．5 h高溫消化，去離子水定容到25 mL，混勻后取5 mL加入1 mL 5%的硫脲-抗壞血酸混合液，混勻后靜置30 min，原子熒光法檢測組織內(nèi)砷蓄積量。

2．4 病理學(xué)觀察 取同部位肝、腎和心組織，用甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，雙盲法在普通光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變，取典型照片進(jìn)行病理學(xué)分析。

2．5 MT-2 mRNA檢測 取肝、腎和心組織50～100 mg，加入細(xì)胞裂解液Trizol 1 mL，按照說明書提取、純化總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和純度，凝膠電泳檢測其完整性，用莫洛尼(氏)鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和寡脫氧胸苷酸逆轉(zhuǎn)MT-2 mRNA，其上游引物序列為TGTGCCTCCGATGGATCCT，下游引物序列 GCAGCCCTGGGAGCACTT，用SYBR Green熒光染料進(jìn)行適時定量PCR擴(kuò)增。用18S做內(nèi)參，通過Ct值比較不同組之間的基因相對差異性表達(dá)。

3 結(jié)果

3．1 組織砷蓄積 由表1可知相同含砷量的六神丸(200 mg/kg)在肝臟組織的蓄積量為260 ng/g大于雄黃(30 mg/kg)組 83 ng/g，而1/2含砷量的As5+組(44 mg/kg)肝組織砷蓄積卻達(dá)到了3 560 ng/g，是六神丸的14倍。這表明六神丸復(fù)方可促進(jìn)砷的吸收和向肝組織的分布，但其蓄積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+組。

表1 原子熒光法測得肝、腎、心組織中砷蓄積量( ± s，n=6)Tab．1 Arsenic contents in mouse liver，kidney and heart( ± s，n=6)

表1 原子熒光法測得肝、腎、心組織中砷蓄積量( ± s，n=6)Tab．1 Arsenic contents in mouse liver，kidney and heart( ± s，n=6)

注:與正常對照組比較，*P＜0．05。正常小鼠組織中含有微量(ng)砷，均在正常范圍［5］。

組別 肝砷蓄積/(ng/g)腎砷蓄積/(ng/g)心砷蓄積/(ng/g)正常對照組六神丸組雄黃組As5+組蟾酥組76±6 261±24*83±7 3561±930*74±8 101±10 188±10*109±7 4 574±1 182*93±5 139±16 161±10 159±19 410±93*131±9

上述給藥量的六神丸在腎臟組織的蓄積量(187 ng/g)略大于雄黃(108 ng/g)，而As5+組肝組織砷蓄積卻達(dá)到了4 574 ng/g，是六神丸的16倍。同樣，六神丸復(fù)方可以促進(jìn)砷的吸收和向腎臟的分布，但其在腎組織的蓄積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+組。

六神丸和雄黃在心肌組織中蓄積很低，As5+組在心肌的蓄積量(410 ng/g)是六神丸的2．5倍，高于雄黃組(159 ng/g)。

3．2 血生化結(jié)果 AST和ALT及BUN是血液中分別反映肝、腎功能的客觀指標(biāo)，如表2顯示，與正常對照組比，六神丸(200 mg/kg)、雄黃(30 mg/kg)、蟾酥(30 mg/kg)對血液中ALT、AST、BUN水平幾乎沒有影響，但As5+組明顯升高血液中AST、ALT和BUN水平，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明六神丸、雄黃、蟾酥在上述劑量下對小鼠的肝腎功能沒有明顯的影響，而As5+卻明顯損傷肝腎功能。

表2 小鼠血清中AST、ALT和BUN水平 ( ± s，n=6)Tab．2 Serum activity of AST，ALT，and BUN level

表2 小鼠血清中AST、ALT和BUN水平 ( ± s，n=6)Tab．2 Serum activity of AST，ALT，and BUN level

注:*表示與正常對照組比較，P＜0．05。

組別 AST/(U/L) ALT/(U/L) BUN/(mmol/L)正常對照組274 ±33．8 47．5 ±6．6 10．2 ±0．4六神丸組 306 ±42．5 60 ±6．6 8．6 ±0．4雄黃組 367 ±58．2 76．8 ±6．3* 10．4 ±0．5 As5+組 507 ±118* 149 ±47．7* 22．4 ±4．3*蟾酥組320 ±47．3 75．2 ±6．3 9．7 ±0．8

3．3 病理學(xué)變化HE染色結(jié)果 由圖1可知，六神丸組、蟾酥組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常，有少量的炎細(xì)胞侵潤，雄黃損傷略重于六神丸，肝細(xì)胞嗜酸性變，輕微點(diǎn)狀壞死。而As5+組肝小葉結(jié)構(gòu)消失，肝細(xì)胞嗜酸性變、壞死，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死及間質(zhì)內(nèi)有炎性細(xì)胞侵潤。

六神丸組、蟾酥組、雄黃組小鼠腎臟皮質(zhì)部腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)完整，近曲小管管腔結(jié)構(gòu)完整，無擴(kuò)張，間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞侵潤。As5+組腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞伴充血腫脹，腎小球球囊腔縮小，近曲小管腫脹，管腔結(jié)構(gòu)消失，有炎性細(xì)胞侵潤，腎小管上皮細(xì)胞點(diǎn)狀壞死。

六神丸、雄黃對心肌組織幾乎無損傷，而蟾酥對心肌組織有輕微損傷，引起心肌細(xì)胞的炎性細(xì)胞侵潤，心肌間質(zhì)充血及點(diǎn)狀壞死，但程度較As5+組為輕，As5+組心肌組織細(xì)胞變性、壞死廣泛，部分心肌細(xì)胞斷裂，心肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂。

3．4 金屬硫蛋白相對表達(dá)量 結(jié)果見表3。與對照組比，六神丸組幾乎不上調(diào)肝組織中MT-2 mRNA的表達(dá)，蟾酥和雄黃組肝組織中MT-2 mRNA的表達(dá)量上升3～4倍，而As5+組肝臟中MT-2 mRNA的表達(dá)量則上升15倍之多。

圖1 各組小鼠肝、腎、心組織病理學(xué)變化(HE染色，×100)Fig．1 Histopathology of liver(A，B)，kidney(C，D)and heart(E，F(xiàn))arrows indicate necrosis(×100)

六神丸、雄黃和蟾酥組腎組織中MT-2mRNA的表達(dá)無明顯變化，而As5+組腎臟中MT-2 mRNA表達(dá)量是對照組的26倍。

六神丸、雄黃組對心肌組織中MT-2 mRNA的表達(dá)均無影響。蟾酥組MT-2 mRNA的表達(dá)量是對照組的3倍，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而As5+組心肌組織中MT-2 mRNA的表達(dá)量是對照組的180倍。此結(jié)果與組織病理學(xué)結(jié)果一致，表明蟾酥對心肌有輕微損傷，其損傷程度遠(yuǎn)小于As5+。

表3 組織金屬硫蛋白M T-2 m RNA的相對表達(dá)量( ± s，n=6)Tab．3 The relative transcrip t levels ofmetallothionein-2(MT-2)in liver，kidney and heart

表3 組織金屬硫蛋白M T-2 m RNA的相對表達(dá)量( ± s，n=6)Tab．3 The relative transcrip t levels ofmetallothionein-2(MT-2)in liver，kidney and heart

注:與正常對照組比較，*P ＜0．05。

組別 肝表達(dá)量 腎表達(dá)量 心表達(dá)量正常對照組六神丸組雄黃組As5+組蟾酥組100±40 113±81 438±161 1 465±609*333±163 100±46 76±26 79±18 2 558±691*91±23 100±58 98±45 48±25 18 130±6 258*311±79

4 討論

六神丸是中國傳統(tǒng)中藥的四大名藥之一，同藥典中的其他23味中成藥一樣因含有雄黃其安全性受到了質(zhì)疑，又因其含砷量超出國際標(biāo)準(zhǔn)而被國外禁止使用。新生兒及嬰幼兒六神丸急性中毒均為一次口服引起。本實(shí)驗(yàn)以正常小鼠為對象，觀察了單次口服給藥后小鼠肝、腎和心肌組織內(nèi)砷蓄積量，血液中肝腎功能指標(biāo)的變化，肝、腎、心組織病理學(xué)改變及金屬硫蛋白表達(dá)的變化，以上各個方面的結(jié)果均證明，六神丸及其組分雄黃、蟾酥毒性遠(yuǎn)小于無機(jī)砷化物As5+。

雄黃又名黃金石、石黃，為硫化物類礦物，主要成分是As4S4，雄黃是國務(wù)院在《醫(yī)療用毒性藥品管理辦法》特別規(guī)定的28種毒性中藥之一［6］。藥典曾兩次降低雄黃的日用量，現(xiàn)為0．05～0．1 g，仍然大大超出國際標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明通過六神丸組方配伍后，雄黃的毒性作用大大減弱［7］，在Beagle犬的毒性研究實(shí)驗(yàn)中證明六神丸全方對雄黃確實(shí)有減毒作用［8］。連續(xù)給予含雄黃的中藥復(fù)方安宮牛黃丸8 h，其毒性遠(yuǎn)小于砷酸氫二鈉(As5+)和亞砷酸鈉(As3+)［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，六神丸組含砷量與雄黃組相當(dāng)，而其組織砷蓄積量大于雄黃組，表明六神丸可以促進(jìn)砷的吸收和向組織分布，這也許與六神丸的藥理作用有關(guān)。但六神丸對組織的毒性卻并不大于雄黃，這可能正是中藥復(fù)方的君、臣、佐、使奧妙之所在。同時，雄黃在肝、腎、心組織砷蓄積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+，血生化、病理學(xué)結(jié)果表明，雄黃對小鼠肝、腎、心的損傷程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+，其誘導(dǎo)肝、腎、心組織中的金屬硫蛋白表達(dá)量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+，所以雄黃的急性毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于As5+，用總含砷量去評價雄黃的毒性是不科學(xué)的。

蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后腺及皮膚腺的干燥分泌物，長期過量服用會導(dǎo)致中毒［3，9］。Beagle 犬一次灌胃六神丸、六神丸去蟾酥和蟾酥，觀察其急性毒性，結(jié)果顯示，六神丸組和蟾酥組都出現(xiàn)了不同程度的心臟毒性，這表明六神丸全方對蟾酥并沒有解毒作用［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蟾酥對小鼠心臟毒性大于肝腎組織，可以造成心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞和形態(tài)的改變，但六神丸組未見明顯的心臟損傷。本實(shí)驗(yàn)蟾酥用藥量是臨床日用量40倍，這提示，大量蟾酥可致心臟毒性，服用蟾酥一定不能過量，心臟功能不好者要慎用。六神丸的毒性不等于蟾酥的毒性，也不等同于蟾酥和雄黃毒性的簡單相加。

金屬硫蛋白(MT)是一類小的富含巰基的金屬結(jié)合蛋白，其巰基可以螯合大量的金屬離子后將其排出體外。MT可以被砷誘導(dǎo)生成，而MT的誘導(dǎo)產(chǎn)生可能是機(jī)體拮抗砷慢性毒性的一個細(xì)胞機(jī)制，可能在砷耐受中起適應(yīng)性作用［11］，因此MT可以作為砷暴露的敏感指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)在分子水平上通過real time RT-PCR檢測MT-2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，臨床用藥量40倍的六神丸組、雄黃組、蟾酥組對肝、腎、心組織中的金屬硫蛋白沒有明顯的誘導(dǎo)作用，而As5+組在肝、腎、心組織中都大量表達(dá)金屬硫蛋白，這再次驗(yàn)證了砷蓄積、血生化和病理學(xué)結(jié)果。

六神丸是耳鼻喉科常備良藥之一，在治療多種疾病時都取得了良好的療效［1-2］，而長期或大量服用六神丸引起的不良反應(yīng)也時有發(fā)生，新生兒服用六神丸引起急性中毒大多數(shù)是由于服用過量所致［12-13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予40倍臨床日用藥量的六神丸，肝腎組織均有輕微的炎癥反應(yīng)，組織砷蓄積量也有所增加，這提示六神丸過量可以產(chǎn)生毒性，臨床服用六神丸一定不要過量。雄黃和蟾酥都具有多方面的藥理學(xué)作用，在治療多種疾病時發(fā)揮著藥理學(xué)效應(yīng)，其在六神丸中所發(fā)揮的藥理學(xué)效應(yīng)及其相關(guān)的作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

砷毒性可因砷的價態(tài)，所處的形態(tài)不同而其毒性也大大不同［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:六神丸對肝、腎、心組織急性毒性遠(yuǎn)小于As5+單體的毒性。其機(jī)制在毒代動力學(xué)上，雄黃在組織的砷蓄積量遠(yuǎn)小于As5+組。在毒效學(xué)方面，雄黃對炎癥和金屬硫蛋白的表達(dá)的影響遠(yuǎn)小于As5+組。因此，用總含砷量評價雄黃和六神丸的毒性是不科學(xué)的。

［1］陸樹萍．淺談六神丸的功用與禁忌［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2006，22(20):3161-3162．

［2］張保國，劉慶芳．六神丸的內(nèi)科應(yīng)用［J］．中成藥，2006，28(9):1360-1362．

［3］鄭險峰，閏 兵，孫靜華．蟾酥對家兔動脈血壓毒性作用的研究［J］．牡丹江師范學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2003，2:3-4．

［4］康 永，李先榮，程 霞，等．雄黃藥理作用的實(shí)驗(yàn)研究及其毒性觀察［J］．時珍國醫(yī)國藥，1998，9(4):322-323．

［5］Lu Yuanfu，Yan Junwen，Wu Qin，et al．Realgar-and cinnabarcontaining An-Gong-Niu-HuangWan ismuch less chronically toxic than common arsenicals and mercurials［J］．Chem Biol Interact，2011，189(1):134-140．

［6］韓 潔，章 呈，傅得興．2005年版《中國藥典》中含雄黃制劑安全性探討［J］．中國中藥雜志，2008，33(13):1638-1640．

［7］吳 倩，梁瓊麟，羅國安，等．六神丸可溶性砷形態(tài)的 HPLICP-MS研究［J］．中國藥科大學(xué)學(xué)報，2007，38(4):332-335．

［8］齊衛(wèi)紅，沈連忠，李 欣，等．Beagle犬重復(fù)給予六神丸28 d及恢復(fù)期14 d毒性研究［J］．毒理學(xué)雜志，2007，21:304．

［9］趙 強(qiáng)，孟凡靜，劉安西．蟾酥的研究進(jìn)展［J］．中草藥，2004，35(10):附 4-附7．

［10］齊衛(wèi)紅，李 欣，沈連忠，等．Beagle犬經(jīng)口給予六神丸急性毒性研究［J］．毒理學(xué)雜志，2007，21(4):303-304．

［11］Klaassen CD，Liu J，Choudhuri S．Metallothionein:an intracellular protein to protect against cadmium toxicity［J］．Annu Rev Pharmacol Toxicol，1999，39(8):267-94．

［12］王厚眷．新生兒六神丸中毒伴心律紊亂二例［J］．實(shí)用兒科臨床雜志，1987(3):166．

［13］吳錦榮．六神丸引起血小板減少性紫癜2例［J］．新醫(yī)藥，1990，21(6):302-303．

［14］Liu Jie，Lu Yuanfu，Wu Qin，et al．Mineral arsenicals in traditionalmedicines:orpiment，realgar，and arsenolite［J］．J Pharmacol Exp Ther，2008，326(2):363．