三七皂苷長循環納米粒的性質研究

趙國巍， 陳緒龍，2， 廖正根*， 梁新麗， 祝婧云， 招麗君， 王春柳

(1．江西中醫學院現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌330004;2．九江學院，臨床醫學院，江西九江332000)

三七皂苷(Panaxnotoginseng saponins，PNS)具有保護心肌、降低血壓、增加心腦血流量等藥理作用［1］。目前市售為常規口服劑型和注射劑，注射劑療效確切，但存在過敏反應等問題;因PNS為易溶解難滲透的Ⅲ類藥物［2］，在胃腸道中不穩定，其口服制劑生物利用度低。納米技術能提高藥物穩定性和滲透性，但納米粒主要集中在單核巨噬細胞豐富的器官，對于靶部位不在這些器官的藥物，藥物在此濃集使得藥物在血液中循環時間短。長循環納米粒能夠解決這些問題，長循環納米粒(long-nanoparticles，NPs)一般是指在普通納米粒的表面用親水性的高分子材料如PEG、PEO、MPEG-PLGA等以物理吸附或化學鍵合的方法進行修飾。長循環納米粒通常對所攜帶的藥物具有緩釋、靶向、保護、提高療效和降低毒副作用等特點［3］。本實驗采用多種分析測試手段對制備的PNS-LCN進行性質研究，為納米粒的質量控制和制劑學研究提供依據。

1 實驗材料

1．1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀(Agilent科技有限公司)，乳化機(FA25 model上海弗魯克流體機械制造有限公司)，Malvern納米粒度儀(英國馬爾文公司)，VERTEX 70型紅外光譜儀(德國Bruker公司)，DSC分析儀(美國 PE公司)，D8ADVANCE型X射線衍射儀(德國Beuker-axc公司)，TEM-l00CX透射電鏡(日本電子公司)，透析袋(Pore size 3000，美國 Fisher Scientific公司)。

1．2 試藥 三七皂苷R1(中國藥品生物制品檢定所，批號:110745-200415)，人參皂苷Rg1(中國藥品生物制品檢定所，批號:110703-200726)，人參皂苷Rb1對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110704-200318)，三七總皂苷樣品(西昌市杰象藥物原料有限公司)，聚乙二醇單甲醚-聚乳酸共聚物(MPEG-PLGA，MPEG ∶PLGA=50 ∶50，分子量20 000，山東省醫療器械研究所)，殼聚糖(Chitosan，脫乙酰度60%，黏度26 mPa·s，浙江金殼生物化學有限公司)，甘露醇(中國醫藥上海化學試劑公司)，膽固醇、卵磷脂(上海楷洋生物技術有限公司)，乙腈、甲醇為色譜純;水為超純水;其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2．1 三七皂苷長循環納米粒的制備及形態觀察采用復乳化法制備［4］，取三七總皂苷適量溶解于pH值為9的水溶液中，作為內水相W1;取MPEG-PLA適量溶解于二氯甲烷中，作為油相O，膽固醇和卵磷脂(1∶1)溶入油相中作為乳化劑;殼聚糖水溶液為外水相W2。混和 W1相與 O相(W1∶O=1∶5，v/v)，振搖分散，然后采用乳化劑高速攪拌120 s制得W1/O乳劑，將上述W1/O乳劑快速加入一定體積的外水相 W2中，(W1/O ∶W2=1 ∶2，v/v)，用乳化機高速攪拌120 s即得W1/O/W2復乳，得到的復乳通過注射器快速注入到45℃條件下中速磁力攪拌的100 mL殼聚糖溶液中，繼續攪拌至二氯甲烷揮發完全，即得乳光明顯的淡藍色的納米粒膠體溶液。加入適量的甘露醇作保護劑，置于－40℃冷凍干燥機中，按優化后的升溫程序干燥，取出后立即壓蓋密封，即得PNS-LCN凍干粉。取已制備好的納米粒凍干粉適量，無水乙醇稀釋后采用透射電鏡(TEM)觀察納米粒的基本形態，結果見圖1。

圖1 PNS長循環納米粒TEMFig．1 The transm ission electron m icroscope investigation of PNS-LCN

PNS-LCN溶液采用反透析法［5］測得其包封率和載藥量分別為52．25%、13．23%。PNS-LCN凍干粉外觀均勻，呈疏松狀物，表面光潔細膩，具有足夠的強度，振搖后能整塊脫落，冷凍工藝較佳。從圖1中看出，PNS-LCN形態圓整，分散性良好，粒徑分布較均勻。

2．2 粒徑及分布、表面電位的測定 分別取凍干PNS-LCN溶液適量，以雙蒸水適當稀釋后，采用馬爾文納米粒度分析儀、Zeta電位儀分別測定納米粒溶液的平均粒徑及粒徑分布、Zeta電位。結果見圖2。

圖2 三七皂苷長循環納米粒粒徑(A)及電位(B)分布圖Fig．2 Particle size(A)and Zeta potential(B)distribution of PNS-LCN

從圖2(A)中可以看出，三七皂苷納米粒平均粒徑及分散系數分別為(147．667±4．497)nm、(0．267±0．042)，其 PNS-LCN 粒徑較小且分布較窄。通常長循環納米粒的平均粒徑在100～250 nm之間時可以避免MPS系統的吞噬，而達到更好的長循環效果，小于150 nm的納米粒靶向骨髓，小于250 nm的納米粒靶向體循環［6］。從圖2(B)中可以看出，Zeta電位為(－44．70±1．47)mV，Zeta電位絕對大于30 mV。一般認為［7］Zeta電位絕對值大于30 mV時，體系是穩定的。

2．3 差示掃描量熱(DSC)分析 以空Al2O3坩鍋為參比，另一Al2O3坩鍋放入樣品，升溫速度10℃/min，掃描范圍30～250℃。結果見圖3。

圖3 各物質的DSC圖譜Fig．3 DSC curves

從圖3中可以看出，當溫度超過140℃時，大豆卵磷脂發生分解，出現多個分解峰，這些峰在物理混合物和PNS-LCN中均觀察不到，可能是由于峰值較小，被其他物質掩蓋;PEG-PLGA為共聚物，在掃描范圍30～250℃內沒有明顯的吸收峰;膽固醇在152℃的吸收峰、甘露醇在177℃吸收峰、殼聚糖在120℃吸收峰及三七皂苷在105℃的吸收峰均在物理混合物中出現，物理混合物的DSC圖譜具有膽固醇、甘露醇、殼聚糖和三七皂苷的譜線疊加的特征，說明物理混合后各物質之間未發生物理化學變化;在PNS-LCN的DSC圖譜中，膽固醇、甘露醇、殼聚糖、三七皂苷的特征吸收峰均消失，且在172℃出現新的吸收峰，表明各物質之間發生了相互作用，可能有新的物相生成。

2．4 紅外光譜(IR)分析 樣品的紅外光譜(IR)測定采用EQUINOX55型紅外光譜儀，每個樣品的紅外光譜為500～4 000 cm－1范圍內掃描16次的累積。紅外光譜圖見圖4。

從圖4中可以看出，大豆卵磷脂在2 882、1 803 cm－1的吸收峰、膽固醇在 3 443、2 885、1 702、1 453、1 396 cm－1的吸收峰、MPEG-PLGA 在 1 793 cm－1的吸收峰及PNS在3 442、2 886 cm－1的吸收峰在物理混合中均存在，說明物理混合后各物質未發生物理化學變化。比較物理混合和納米粒的紅外光譜，膽固醇、PNS位于3 443 cm－1吸收峰在物理混合中吸收較強，而在納米粒中則較弱;膽固醇、PNS位于2 886 cm－1吸收峰在物理混合中出現，而在納米粒中吸收峰消失，這種吸收強度的變化、吸收峰的消失等，說明各物質之間發生了分子間作用。

圖4 各物質的紅外光譜分析Fig．4 IR spectra

2．5 X射線衍射(XRD)分析 樣品的X射線衍射分析在D/Max-3c型X射線衍射儀上進行，掃描范圍2θ為:3°～65°Cu Kα 靶，管電壓60 kV，管電流30 mA，采樣間隔為0．02°。X-ray分析見圖5。

圖5 各物質的XRD圖譜Fig．5 X-ray diffraction patterns

從圖5中可以看出，大豆卵磷脂、殼聚糖、MPEG-PLGA和PNS沒有顯著的衍射峰，只有非晶峰，這些非晶峰較小，在物理混合物中被其它物質的衍射峰掩蓋;膽固醇在5°和甘露醇的全部衍射峰均在物理混合物中出現，物理混合物的X-ray圖譜具有膽固醇和甘露醇的譜線疊加的特征。對比圖5(7)和(8)，可以看出PNS-LCN和物理混合物的的主要特征峰明顯不同，PNS-LCN相對于物理混合，晶體衍射峰減少，2θ為 11°、15°、18°、23．5°、29°等晶體峰消失，且在 2θ為 9°、25°、28°、41°均出現新的晶體衍射峰，表明PNS-LCN中有新的晶型生成。空白納米粒衍射譜相對于物理混合其晶體衍射峰的強度減弱，這說明除了PNS，各輔料之間也發生分子間的作用;比較空白納米粒和載藥納米粒衍射譜，載藥納米等晶體峰消失，且出現新的晶體衍射峰，這表明PNS不是簡單的作為模型藥物，而且其在納米粒形成的過程中與各輔料之間發生了分子間的作用，并改變物料的性質。

2．6 體外溶出度考察

2．6．1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18(4．6 mm ×150 mm，5 μm);流動相:乙腈-水，其梯度洗脫條件為:0～15 min，乙腈由20%線性增加到21．5%，15～36 min，乙腈由21．5%線性遞增到40%;體積流量:1．0 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:203 nm。

2．6．2 液相色譜系統的可行性驗證 按2．1項方法分別制備空白納米粒和載藥納米粒，按色譜條件測定，色譜圖見圖6。空白納米粒中無干擾三七總皂苷測定的物質，表明該色譜系統適用于三七總皂苷的測定。

2．6．3 體外溶出 采用透析法，精密移取PNS溶液、PNS-LCN溶液，分別裝入已處理好的透析袋中，將透析袋兩端扎緊，置于200 mL pH7．4磷酸鹽緩沖溶液［8］中，保持漏槽狀態，容器口密閉，恒溫(37±1)℃，恒速(100 r/min)攪拌，定時取樣0．5 mL，同時補加同體積同溫度的釋放介質，平行3份。從所取樣品中取10μL進樣，計算累積釋藥量。結果見圖7。

PNS-LCN在前12 h內的釋放的速度比較快，這是因為納米粒周圍游離的三七皂苷所致，12 h之后藥物的釋放速度比較緩慢，這可能與聚合物骨架材料的降解速度有關。

2．6．4 模型擬合 PNS和PNS-LCN在達到釋放平衡時間內，將釋放時間(t)與藥物的累積溶出百分率(Q)分別用零級釋放模型、一級釋放模型、Weibull模型和Higuchi模型進行擬合［9］，結果見表1。

2．6．5 溶出數據分析 從表1中可以看出，PNS、PNS-LCN均為Weibull模型擬合較好。根據威布爾分布函數的處理方法，計算PNS的T50、TD分別為3．59 h、6．07 h;PNS-LCN T50、TD分別為 11．27 h、20．31 h。PNS、PNS-LCN 溶出參數 T50、TD值比較均有顯著性差異(P＜0．01)，表明三七皂苷制成納米粒之后其內在質量產生較大差異。

圖6 高效液相色譜圖Fig．6 HPLC chromatograms

圖7 PNS、PNS-LCN體外釋放曲線(n=3)Fig．7 Release curves of PNS and PNS-LCN(n=3)

表1 三七皂苷納米粒溶出數據的擬合方程Tab．1 The fitting equations of release date of PNS-LCN

3 討論

結合IR、DSC和XRD的分析結果，表明PNSLCN中殼聚糖、PEG-PLGA等和PNS之間發生了分子間作用，有新的物相即新晶形生成。

PNS-LCN具有明顯的緩釋作用，PNS的體外釋藥參數 T50、TD分別延長了約3．13倍和3．34倍。結果說明MPEG-PLGA長循環納米粒有望在緩釋和控釋給藥系統中獲得重要的應用。

本研究采用 TEM、IR、DSC、XRD、釋放度等多種表征手段，對PNS-LCN的理化性質進行了系統研究，為三七皂苷納米粒的質量評價及鑒定提供試驗依據和納米制劑學研究和質量控制提供依據。

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