HPLC法測定丹參清解口服液中原兒茶醛和黃芩苷

吳麗紅， 儲忠英， 劉惠軍

(上海市松江食品藥品檢驗所，上海201600)

丹參清解口服液是復旦大學附屬華山醫院生產的醫院制劑［1］，由丹參、黃芩、白芷、桑白皮、麥飯石五味藥材組成，其中丹參和黃芩是主藥，具有清熱解毒，活血化瘀之功效，在方中起著重要治療作用。原制劑質量標準只有丹參和黃芩的定性鑒別和口服劑項下規定的檢查項目，為了能更有效地控制該制劑質量，本實驗采用HPLC法對制劑中所含原兒茶醛和黃芩苷同時進行定量測定。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 Agilent HP1100高效液相色譜儀(自動進樣器，二極管陣列檢測器，四元泵);萬分之一電子分析天平(METTLER AG135);超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1．2 試劑 甲醇(色譜純，德國默克)，水為超純水;其余試劑均為分析純。

1．3 對照品 原兒茶醛對照品(110810-200506)、黃芩苷對照品(110715-200514)供定量測定用，均購自中國藥品生物制品檢定所。

1．4 樣品 丹參清解口服液(復旦大學附屬華山醫院生產，規格為 10 mL/支，批號 20100708、20100904、20101118)。

2 方法與結果

2．1 色譜條件 色譜柱［2-4］:Eclipse XDB-C18(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相［5］:甲醇為流動相 A，以1%醋酸溶液為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫［2，5-8］;檢測波長［2，8-12］280 nm，體積流量 1．0 mL/min;進樣量10μL，理論板數按原兒茶醛計算應不低于4 000。

2．2 對照品溶液的制備 分別精密稱取原兒茶醛對照品和黃芩苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含原兒茶醛10μg、黃芩苷20μg的混合溶液。

2．3 供試品溶液的制備 精密吸取本品1 mL，置5 mL量瓶中，加 50% 甲醇適量［6-7］，超聲處理 30 min［11］，放冷，加 50% 甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為測定原兒茶醛的供試品溶液;精密量取上述續濾液1 mL，置100 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為測定黃芩苷的供試品溶液。

2．4 陰性空白樣品溶液的制備 按處方組成，分別制備不含丹參和不含黃芩的兩種陰性模擬制劑，照上述供試品溶液的制備方法制成空白溶液。

2．5 系統適用性實驗 取供試品溶液、對照品溶液和兩種陰性空白樣品溶液，在上述色譜條件下進樣10μL，記錄色譜圖，結果見圖1～5。由色譜圖知，理論板數按原兒茶醛峰計算不低于4 000，原兒茶醛的保留時間約12．4 min，黃芩苷峰的保留時間約26．0 min，陰性對照溶液在原兒茶醛峰和黃芩苷峰位置均無干擾峰。原兒茶醛、黃芩苷與其他組分可完全分離。

圖2 不含黃芩陰性對照溶液HPLC色譜圖Fig．2 HPLC chromatogram of negative sam p le w ithout Scutellariae Radix

圖3 不含丹參陰性對照溶液HPLC色譜圖Fig．3 HPLC chromatogram of negative sam ple w ithout Salviaemiltiorrhizae Radix et Rhizoma

圖4 原兒茶醛供試品溶液HPLC色譜圖Fig．4 HPLC chromatogram of sam ple for protocatechuic aldehyde

2．6 線性范圍

圖5 黃芩苷供試品溶液HPLC色譜圖Fig．5 HPLC chromatogram of samp le for baicalin

2．6．1 原兒茶醛線性 取原兒茶醛對照品配制成質量濃度分別為2．460、4．920、9．840、19．68、24．60、29．52 μg/mL 的系列溶液，分別進樣 10 μL在上述色譜條件下測定峰面積，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，測得回歸方程:Y=44．700 83X－1．300 52，r=0．999 99，表明原兒茶醛在 2．460 ～29．52μg/mL范圍內線性關系良好。

2．6．2 黃芩苷線性 取黃芩苷對照品配制成質量濃度分別為 4．844、9．688、19．376、38．752、48．440、58．126μg/mL的系列溶液，分別進樣10μL在上述色譜條件下測定峰面積，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，測得回歸方程:Y=34．927 47X－1．492 65，r=1．000 00，表明黃芩苷在4．843 8 ～58．126 0μg/mL范圍內線性關系良好。

樣品測定時以外標法兩點法計算原兒茶醛和黃芩苷的量。

2．7 精密度實驗 分別精密吸取原兒茶醛、黃芩苷同一供試品溶液，連續重復進樣6次，每次進樣10 μL，測定原兒茶醛和黃芩苷峰面積積分值，結果原兒茶醛相對標準偏差RSD為0．18%(n=6);黃芩苷相對標準偏差RSD為0．24%(n=6)。

2．8 穩定性實驗 分別精密吸取原兒茶醛、黃芩苷同一供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、10、24 h，精密吸取10μL注入液相色譜儀，測定原兒茶醛和黃芩苷峰面積積分值，結果原兒茶醛相對標準偏差RSD為0．13%;黃芩苷相對標準偏差RSD為0．11%。

2．9 重復性實驗 取同一批供試品，分別平行制備6份供試液，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測定含量，原兒茶醛相對標準偏差RSD為1．27%(n=6)，黃芩苷相對標準偏差RSD為1．08%(n=6)，說明方法重復性好。

2．10 回收率實驗 采用加樣回收法，精密吸取已知量的樣品(批號20100708)0．5 mL，精密加入原兒茶醛對照品溶液(質量濃度為0．024 6 mg/mL)和黃芩苷對照品溶液(質量濃度為4．843 8 mg/mL)各0．8 mL、1．0 mL、1．2 mL，按供試品溶液制備方法操作，制成原兒茶醛加樣供試品溶液。精密吸取上述續濾液1 mL，按供試品溶液制備方法操作，制成黃芩苷加樣供試品溶液。精密吸取上述加樣供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，按上述方法測定加樣供試品溶液中原兒茶醛和黃芩苷的量，計算回收率，結果原兒茶醛平均回收率為100．5%，RSD為0．95%(n=6);黃芩苷平均回收率為100．5%，RSD為0．80%(n=6)，結果見表2，3。

表2 原兒茶醛回收率實驗Tab．2 Results of recovery test of protocatechuic aldehyde

表3 黃芩苷回收率實驗Tab．3 Results of recovery test of baicalin

2．11 樣品測定 按2．2項和2．3項制備成供試品溶液和對照品溶液，精密吸取供試品溶液及對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，依法測定，以外標法兩點法計算原兒茶醛和黃芩苷的量，即得。結果樣品批號為 20100708、20100904、20101118中原兒茶醛的質量濃度分別為 50．98 μg/mL、47．65 μg/mL、30．52 μg/mL;黃芩苷的質量濃度分別為 10．14 mg/mL、9．41 mg/mL、8．60 mg/mL，具體見表 4。

表4 樣品測定結果(n=3)Tab．4 Determ ination results of sam ple(n=3)

3 討論

3．1 檢測波長的選擇 因為是在一個系統中同時檢測原兒茶醛和黃芩苷，所以找到他們共同的最大吸收波長尤為重要，取上述兩種對照品加50%甲醇溶液于紫外掃描儀上繪制紫外吸收光譜，波長范圍200～400 nm，結果原兒茶醛和黃芩苷均在(280±2)nm有最大吸收波長。

3．2 供試品提取方法的確定 在供試品的提取中，分別采取超聲(20 min、30 min和60 min)、乙醚振搖提取［6］(3、4、5 次)和加熱回流(30 min、60 min、120 min)3種方法進行試驗，結果發現原兒茶醛在超聲30 min提取測得量最高，黃芩苷在上述各種提取方法中測定量結果相差不大，故選用超聲30 min作為本實驗供試品提取方法。

3．3 流動相比例確認 通過文獻查找，發現測定原兒茶醛的流動相甲醇-1%冰醋酸(13∶87)較多，而測定黃芩苷的流動相甲醇-1%冰醋酸(45∶55)較多，兩者流動相比例相差較大，本實驗曾用甲醇-1%冰醋酸不同比例等度進行調節測試，均不能滿意同時檢測到兩種成分，后經摸索采用梯度洗脫調節流動相比例能得到很好的峰形，分離完全，雜峰干擾少，理論塔板數高達10 000多。

3．4 丹參測定成分的選擇 丹參有效成分較多，可分為脂溶性和水溶性兩部分。脂溶性成分主要為丹參酮IIA，水溶性成分包括丹酚酸B、丹參素、原兒茶醛等。本制劑的制法是水煎法，脂溶性成分丹參酮IIA量很低，難以檢測。同時由于中藥復方中成分復雜，在實驗條件下，水溶性成分丹酚酸B、丹參素與相鄰峰不能分離，不符合定量測定要求。因此，本實驗選擇參考《中國藥典》2010版丹紅化瘀口服液的含量測定項，選擇丹參有效成分原兒茶醛為測定指標成分。

3．5 測定方法 樣品定量測定中每批所含的原兒茶醛和黃芩苷的量各不相同，可能是每批所用原藥材含量不同所致，因此很有必要對原兒茶醛和黃芩苷的量作相應的控制。本方為復方制劑，藥味雖不多，但成分復雜，經多次試驗，結果表明本方法的色譜條件柱效最高，分離度大，精密度高，重復性好，無干擾，且配制簡單，能有效地控制該制劑的內在質量。

［1］SYZ-ZF-003-2004．上海市食品藥品監督管理局醫療機構制劑質量標準［S］．

［2］衛生部頒藥品標準:中藥成方制劑第十七冊［S］．1998:174．

［3］呂文海，譚 鵬，宋 磊，等．山東臨沂不同加工方法丹參飲片中原兒茶醛含量測定［J］．中國中藥雜志，2006，31(21):1825-1826．

［4］汲臣杰，李雪松．HPLC法測定丹參口服液中原兒茶醛的含量［J］．黑龍江醫藥，2006，19(5):336-337．

［5］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫藥科技出版社，2010:579．

［6］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫藥科技出版社，2010:611．

［7］國家藥品標準(新藥轉正標準)中藥第39冊［S］．15．

［8］馬家燕．對不同品種，不同產地丹參藥材中原兒茶醛及丹參素含量的比較分析［J］．中國鄉村醫藥，2000，7(11):28-29．

［9］張玲莉，彭 燕，涂 毅．高效液相色譜法測定黃芩口服液中黃芩苷的含量［J］，中國藥師，2005(5):388-389．

［10］張 玲，徐新剛．9種含丹參中成藥中原兒茶醛的含量測定［J］．藥物分析雜志，1997，17(4):253-255．

［11］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫藥科技出版社，2010:401．

［12］徐德然，王康才，王崢濤，等．丹參中丹參素、原兒茶醛來源的初步研究［J］．中國天然藥物，2005，3(3):148-150．