頂空氣相色譜法測定貫葉金絲桃提取物中大孔樹脂有機溶劑殘留物

樊敏偉， 秦 晶， 何紅偉， 韓麗妹， 王建新*

(1．復旦大學藥學院藥劑學教研室教育部和全軍智能化遞藥重點實驗室，上海201203;2．國家中藥制藥工程技術研究中心，上海201203)

貫葉金絲桃Hypericum perforatum L．是藤黃科金絲桃屬植物，主要用于抑郁癥和焦慮癥的治療，對艾滋病和腫瘤也有一定療效，是歐美國家最受歡迎的植物藥之一［1-2］。貫葉金絲桃提取物是采用乙醇提取、苯乙烯型大孔吸附樹脂純化技術制備的天然藥物有效部位，主要含有黃酮類、金絲桃素類和貫葉金絲桃素類成分［3-5］。

大孔樹脂是一種不含交換基團并具有大孔結構的高分子吸附劑［6-8］，在其制備過程中使用了苯乙烯和二乙烯苯等作為原料，并加入了一定比例的致孔劑，目前市售的大孔樹脂中大都含有未聚合的單體、交聯劑、致孔劑、分散劑及防腐劑等，這些有機物可能會在應用過程中帶入提取物從而產生毒性。所以在新藥研究時，應建立提取物中大孔樹脂有機溶劑殘留物的檢測方法，并制訂合理的限量標準［9］。本實驗建立了頂空氣相色譜法測定貫葉金絲桃提取物中7種有機溶劑殘留物的方法，為它們的限量控制提供方法和依據。

1 儀器與試劑

HP6890氣相色譜儀，HP7694頂空進樣儀，FID檢測器(美國Agilent公司)。正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯均為色譜純;十二烷基硫酸鈉為分析純;3批貫葉金絲桃提取物樣品(批號::20081214、20081220、20081227，自制)。

2 方法與結果

2．1 色譜條件 色譜柱:HP-INNOWAX毛細管色譜柱(30 mm ×0．25 mm ×0．25 μm);檢測器:氫火焰離子化檢測器;載體:氮氣，體積流量:2．0 mL/min;柱溫:50℃，進樣口溫度:260℃;檢測器溫度:300℃。采用頂空進樣，頂空進樣瓶120℃加熱15 min;進樣體積1 mL。理論塔板數以甲苯峰計，應不少于70 000。

2．2 溶液的配制與測定

2．2．1 對照品溶液的制備 精密稱取正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯適量，加入0．6%十二烷基硫酸鈉溶液，搖勻，制成每1 mL 中分別含 15 μg，10 μg，12 μg，12 μg，13 μg，16μg和13μg的對照品溶液。精密量取5 mL置20 mL頂空取樣瓶中，即得。另取0．6%十二烷基硫酸鈉溶液，作為空白對照溶液。

2．2．2 供試品溶液的制備 取貫葉金絲桃提取物約0．2 g，精密稱定，置頂空瓶中，加入0．6%十二烷基硫酸鈉溶液5 mL，振搖混勻，即得。

2．2．3 樣品的色譜圖 對照品、空白及供試品的色譜圖見圖1，可見各溶劑的色譜峰可被完全分離，且空白溶劑不干擾測定。

圖1 貫葉金絲桃大孔樹脂提取物中有機溶劑殘留物氣相色譜圖Fig．1 The gas chromatography of organic residues from macroporous adsorption resin in St．John’sW ort extract

2．3 線性范圍考察 精密量取對照品溶液適量，加0．6%十二烷基硫酸鈉溶液稀釋成6種不同質量濃度的系列溶液，分別取上述各溶液，進樣測定。以質量濃度為橫坐標，峰面積平均值為縱坐標，進行線性回歸，結果見表1。

表1 回歸方程與線性范圍(n=3)Tab．1 Regression equations and linear range

2．4 精密度試驗 取對照品溶液，按上述方法進樣測定，重復6次，正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯對照品溶液的RSD分別為 6．4%，2．9%，3．2%，3．7%，3．7%，4．3% 和5．9%，表明精密度良好。

2．5 重復性試驗 分別稱取貫葉金絲桃提取物(批號:20081214)約0．2 g，共6 份，按照2．2．2 項下方法進行處理并進樣測定，結果甲苯峰面積的RSD為6．7%，其余有機溶劑均未檢出。

2．6 回收率實驗 稱取貫葉金絲桃提取物(批號:20081214)約0．2 g，精密稱定，置20 mL頂空取樣瓶中;然后精密量取對照品溶液5 mL，加入取樣瓶中，混合均勻，進樣測定，計算樣品中各有機溶劑的濃度并計算加樣回收率。結果顯示正己烷、苯、甲苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯的平均回收率分別為 104．1%，92．3%，87．8%，86．0%，82．6%，89．1%和 85．4%。

2．7 樣品測定 取貫葉金絲桃提取物3批(批號:20081214、20081220、20081227)，按照上述方法進行處理和進樣測定。結果表明，3批樣品中均檢測出甲苯，質量分數分別為0．001 3% ，0．001 6% 和0．003 7%，而正己烷、苯、對二甲苯、鄰二甲苯、苯乙烯和1，2-二乙基苯等均未檢出。

3 討論

3．1 本實驗采用頂空自動進樣技術，使待測物揮發后直接進樣檢測分析，免去樣品的萃取、濃縮等前處理步驟，縮短樣品處理時間，提高樣品處理效率，還可以避免長時間放置對樣品最終檢測結果的影響［10］。同時頂空進樣也可以避免待測樣品中非揮發性組分對色譜柱的污染。結果表明該方法準確、可靠、快速、靈敏，適用于貫葉金絲桃大孔樹脂提取物中有機殘留溶劑的控制。

3．2 溶劑的選擇 由于待測定成分較多且殘留物含量較少，導致峰面積小，故先后摸索了幾種溶劑，如二甲基甲酰胺、二甲亞砜和十二烷基硫酸鈉溶液等，發現十二烷基硫酸鈉溶液對測定干擾較小且溶解度適宜。當十二烷基硫酸鈉溶液的濃度為0．6%時，各有機溶劑的響應即峰面積最大，因此選擇其做為測定溶劑。

3．3 頂空溫度與加熱時間的選擇 待測定的各有機溶劑的沸點在69℃ ～178℃范圍內，考慮到本法采用的溶劑為水溶液，故頂空加熱溫度選擇在120℃;頂空加熱時間經考核，10 min和15 min各成分的峰面積一致，25min峰面積均略為增加，但加熱時間太長水溶液易爆沸，故確定加熱時間為15 min。

3．4 采用本實驗建立的頂空氣相色譜法對3批貫葉金絲桃大孔樹脂提取物中有機殘留物進行測定，結果顯示3批樣品中除含有微量甲苯外，其余有機溶劑均未檢出，符合根據中國藥典2010年版二部附錄Ⅷ P“殘留溶劑測定法”［11］和國家藥品審評中心“大孔吸附樹脂分離純化技術專題討論會會議紀要”［12］的規定。

［1］Greeson JM，Sanford B，MontiD A．St John’swort(Hypericum perforatum):a review of the current pharmacological，toxicological，and clinical literature［J］．Psychopharmacology，2001，153:402-414．

［2］李 宏，姜懷春，鄒國林．貫葉連翹活性成分研究新進展［J］．中草藥，2001，32(7):657-659．

［3］殷志琦，葉文才，趙守訓．國產貫葉連翹化學成分的研究［J］．中國藥科大學學報，2002，33(4):277-279．

［4］石永平，汪 海．高度富集黃酮類成分的貫葉連翹提取物抗抑郁作用［J］．中藥新藥與臨床藥理，2006，17(1):4-7．

［5］王 剛，馬忠仙，譚莉莉．貫葉連翹總黃酮的純化工藝研究［J］．中國實驗方劑學雜志，2010，16(10):11-14．

［6］于智峰，王 敏．大孔吸附樹脂在黃酮類化合物分離中的應用［J］．中藥材，2006，29(12):1380-1383．

［7］閆 磊，何再安，劉焱文．大孔吸附樹脂在中藥研究中的應用［J］．時珍國醫國藥，2006，17(12):2585-2586．

［8］郭麗冰，王 蕾．常用大孔吸附樹脂的主要參數和應用情況［J］．中國現代中藥，2006，8(4):26-32．

［9］胡 軍，周躍華．大孔吸附樹脂在中藥成分精制純化中的應用［J］．中成藥，2002，24(2):127-130．

［10］石云峰，金樟照．頂空氣相色譜法測定中藥提取物的有機溶劑殘留量［J］．中國藥業，2007，16(19):12-13．

［11］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版二部［S］．北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄ⅧP，61-65．

［12］陸 彬．中藥新劑型與新技術［M］．北京:化學工業出版社，2007，91-93．