維藥沒食子血清藥化初步研究

霍仕霞， 彭曉明， 高 莉， 周 露， 斯拉甫·艾白

(新疆維吾爾醫藥研究所，新疆維吾爾醫方劑學實驗室，新疆烏魯木齊830049)

中藥血清藥化是以血液中的有效成分為研究對象，采用現代分析方法鑒定口服中藥后血清中藥源性成分及移行成分，它能夠直觀地分析中藥口服后的血液中的形態表現，快速尋找藥效物質基礎。沒食子Galla Turcica是新疆維吾爾醫常用藥，它是沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂Cynips gallae-tinctorice Oliv．的幼蟲，寄生于殼斗科植物沒食子樹Quercus infectoria Oliv．幼枝上，所產成的蟲癭。沒食子富含鞣質，約占50% ～70%，其次為沒食子酸、丙酸、樹脂等。其中沒食子鞣質具有收斂、抗炎、鎮痛、抗免疫、抗病毒、降血脂、降血糖［1-2］等作用。而沒食子鞣質是在體內以何種形式發揮作用，至今尚未見有報道，本研究在建立沒食子高效液相色譜指紋圖譜的同時，應用血清藥物化學方法，分析比較沒食子粉末與提取物含藥血清指紋圖譜，快速分析和篩選沒食子活性成分，研究其可能的作用物質基礎。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

高效液相色譜儀:Waters1525二元泵高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測器，Waters2996紫外檢測器，Empower數據采集系統(美國);TGL-16B型離心機(上海安亭科學儀器廠制造);SGT7200HBT型超聲清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);Milli-Q超純水純化系統(18 MΩ，Millipore公司);BS110S電子天平(北京賽多利斯有限公司)。

1．2 試藥

沒食子購于新疆維吾爾自治區維吾爾醫醫院，經鑒定為沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂Cynips gallaetinctoriae Olivier的幼蟲寄生于沒食子樹上的蟲癭。沒食子酸對照品(批號:110831-200803)購于中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純;磷酸(優級純，天津市化學試劑三廠);普通氮氣(≥99%，新疆康迪實業發展有限公司)。

1．3 動物

清潔級Wistar大鼠，6～8周齡，質量(200±20)g，雄性，由新疆實驗動物研究中心提供，許可證號:SYXK(新)2003-0003。每組各5只。

2 方法與結果

2．1 色譜條件［3］

通過對比選擇不同檢測波長、柱溫、不同流動相和洗脫方法，對供試品溶液進行HPLC分析，對所獲取的供試品色譜圖中所呈現色譜峰的個數、分離度、峰對稱性、峰面積等參數進行比較和分析，最終確定色譜條件為:Waters symmetry ShieldTMRP18色譜柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為甲醇-0．2%磷酸水溶液;檢測時間50 min;柱溫30℃;體積流量1 mL/min;進樣量20μL;檢測波長270 nm;梯度洗脫程序如表1所示。

表1 梯度洗脫程序Tab．1 Gradient elution program

2．2 供試品溶液的制備［4］

2．2．1 沒食子供試液的制備 取沒食子粉末(過40目篩)5 g，加入水溶液50 mL，超聲提取兩次，料液比1∶10，時間60 min和30 min，過濾，合并濾液，再用雙蒸水定容到250 mL棕色量瓶中(母液C=10 mg/mL)，溶液過0．45μm微孔濾膜，取濾液20μL進行HPLC分析。

2．2．2 沒食子灌胃液的制備

(1)沒食子粉末灌胃液制備 沒食子藥材常規粉碎，過100目篩，用CMC-Na制備成混懸液，濃度為40%，備用。

(2)沒食子超微粉灌胃液制備 沒食子藥材經常規粉碎后，進一步超微粉碎，經檢測，平均粒徑75 μm以內，用CMC-Na制備成混懸液，濃度為40%，備用。

(3)沒食子提取物 沒食子藥材粉碎成粗粉(過40目篩)，水溶液回流提取兩次，每次1 h，合并濾液，70℃濃縮，55℃真空干燥，粉碎成細粉，用CMC-Na制備成混懸液，濃度為24%(按出膏率折算等效劑量)，備用。

2．3 對照品溶液的制備

取沒食子酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含3μg的溶液，即得。

2．4 血清樣品的采集和處理［5-6］

2．4．1 給藥與采血 Wistar大鼠隨機分為給藥組和空白組，每組5只，禁食12 h(自由飲水)，給藥組以藥液量20 mL/kg灌胃，空白組給予同體積的蒸餾水，每日2次，連續3 d。末次給藥后1．5 h，乙醚麻醉，大鼠腹主動脈采血，低速離心，分離血清，置－20℃冰箱中冷凍備用。

2．4．2 血清樣品的處理 取空白及給藥組血清各2 mL，加10 mL甲醇，搖勻后，微量振蕩器振蕩5 min，放置4～5 h，自然沉淀蛋白，吸取上清液，置10 mL試管中，用氮氣濃縮約0．5 mL，用甲醇沖洗全部轉移至1．5 mL EP管中，氮氣吹干，殘渣用0．2 mL甲醇溶解(若渾濁可10 000 r/min離心處理)，上清液過0．45μm濾膜，取20μL經HPLC分析。

2．5 高效液相色譜分析

按2．1項下液相色譜條件，分別測定沒食子供試液、沒食子常規粉末含藥血清、沒食子超微粉含藥血清、沒食子提取物含藥血清和空白血清的高效液相色譜指紋圖譜(見圖1)。本課題組前期研究［7］建立了沒食子藥材指紋圖譜，標定了7個共有峰，故本研究以這7個共有峰為研究入血的主要考察峰。通過比較沒食子含藥血清與空白血清色譜峰，3種含藥血清均出現了3個相同的新色譜峰，即1，a，5號峰，超微粉含藥血清中出現1個不同的新色譜峰，即3號峰，結果見圖1(B，C，D)。與沒食子供試液的指紋圖譜比對，1，3，4，5號峰分別一一對應，表明沒食子中有4個成分以原型的形式吸收入血。而峰a是沒食子含藥血清的特有峰，原因可能是沒食子經大鼠口服后在體內的代謝產物。研究中采用沒食子酸標準品，進行色譜峰比對，發現1號峰的保留時間與沒食子酸標準品的色譜峰保留時間吻合，由此可知，給予大鼠沒食子后，血液中的確有沒食子酸的存在;而在沒食子含藥血清色譜圖中b號峰位置，沒食子供試液和空白血清在相近位置上都出現此峰，該色譜峰僅是血清中的固有成分，還是血清固有成分與沒食子原型成分的疊加，有待采用質譜及核磁共振波譜等檢測方法做進一步考察［8-11］。

A．沒食子供試品 B．沒食子常規粉末含藥血清 C．沒食子超微粉含藥血清 D．沒食子提取物含藥血清 E．空白血清A．sample B．conventional powder containing serum C．serum containing ultrafine D．extracts containing serum E．blank serum

3 討論

本研究在分析沒食子供試品和血清樣品時，均采用了完全相同的色譜條件，因此，建立的沒食子供試品HPLC指紋圖譜與含藥血清的HPLC指紋圖譜中的色譜峰能夠滿足一一對應的關系，同時進行了方法學考察，均滿足分析檢測的要求。在處理血清樣品時，考察了有機試劑沉淀法、熱水浴法，考慮處理方法對色譜峰的干擾影響，最終確定采用甲醇沉淀法處理血清樣品，用氮氣低溫濃縮法富集血中的成分，以便獲得更多的信息。

本研究采用血清藥物化學的方法對維藥沒食子進行研究;通過比較沒食子水提取物、沒食子常規粉末、超微粉、提取物含藥血清和空白血清HPLC指紋圖譜的差異，確定5個血中移行成分，其中4個為原型成分，1個可能為原型成分的代謝產物，4個入血成分可能為沒食子的體內直接作用物質，對其進行深入的研究，將有助于闡明沒食子藥效物質基礎及藥效機制。在測定沒食子粉末、超微粉、提取物中的鞣質及水解前后的沒食子酸時，發現沒食子中的主要成分以沒食子鞣質為主，且鞣質質量分數大于50%，水解前沒食子酸的質量分數僅為2%左右，水解后沒食子鞣質降解為沒食子酸存在，故在本次研究中發現3種含藥血清中均含有沒食子酸峰，很有可能是沒食子鞣質在大鼠體內經過胃腸道作用，在不同的pH環境下，降解為沒食子酸，吸收入血，這提示沒食子的作用物質有可能是沒食子鞣質在體內降解后的沒食子酸。

沒食子超微粉含藥血清中的3號峰與供試液有對應關系，而其他兩種含藥血清均無對應關系，表明3號峰所對應的成分經超微粉碎后，在實現藥材細胞級破壁微粉碎的同時，使其從細胞內暴露出來，藥物的釋放速度及釋放量增加，大幅度提高了吸收的速度，故在血清指紋圖譜比較時，超微粉含藥血清色譜峰中的3號峰能夠與沒食子供試液吻合。而常規粉末和提取物的含藥血清的色譜峰中卻無此峰，沒食子提取物雖然經過溶劑浸泡提取的過程，但該成分很可能在提取的過程中被破壞，均表明超微粉碎有其獨到的優勢，更有利于藥物有效成分的在機體內的吸收、利用，提高生物利用度［12-13］。提取物含藥血清中4號峰與供試液有對應關系，表明該峰所對應的成分經水溶液煎煮后，形成特定的狀態，更有利于大鼠吸收，優于超微粉;可見，選擇合適的制備工藝，其有效成分是否能夠被機體吸收利用是最重要的。

通過血清藥化的研究方法初步研究沒食子的入血成分及代謝產物，為研究其作用物質及有效成分的代謝吸收提供有力的證據。4個直接入血成分的性質及藥理作用，后續研究將繼續從原藥材中制備、分離、純化入血成分，代謝產物及其前體化合物的推導，進一步通過液質聯用及液核聯用技術進行相關的考察，以期獲得更多的信息，為開發維藥沒食子提供技術支持。

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