不同橘核炮制品中檸檬苦素和諾米林的測定

何中燕， 裴 瑾*， 莫書蓉， 劉 瑛， 潘曉麗

(1．成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610075;2．成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院，四川成都610015)

橘核為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟種子，具有理氣，散結(jié)，止痛的功效，用于疝氣疼痛，睪丸腫痛，乳癰乳癖［1］。關(guān)于橘核歷代有多種炮制方法，如宋代和明代有炒法，《證類本草》中記載:“炒研為末。”、《普濟(jì)方》中記載:“炒令黃色，去殼，為末。”，清代在炒法的基礎(chǔ)上又增加了鹽炒、炒焦、青鹽拌炒、酒焙和鹽酒炒等方法，其中酒制法近代已不復(fù)用。除了上述各種外，近代又出現(xiàn)了麩炒和鹽炙兩種新的炮制方法，其中鹽炙法似系清代的鹽炒法衍變而來［2］。現(xiàn)代研究表明，橘核中主要的活性成分為檸檬苦素類化合物，該類化合物具有明顯的抗腫瘤［3-4］，鎮(zhèn)痛抗炎［5］以及殺蟲［6］等藥理作用。目前已分離得到了約300多種檸檬苦素類化合物，柑橘屬中有50多種，其中包括38種檸檬苦素類似物苷元和20種配糖體［7］，目前檢測此類化合物的方法主要有 TLC法［8］、UV法［9］、HPLC法［10］等，檸檬苦素和諾米林在橘核中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高［11］，故本研究選擇此兩種有效成分作為指標(biāo)成分，對中藥橘核現(xiàn)代常用的幾種炮制品(生品，麩炒品，清炒品，鹽炙品)進(jìn)行較為準(zhǔn)確的HPLC測定，探討炮制后成分變化，為其質(zhì)量評價提供一定依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 島津高效液相色譜儀(LC-10AVP)和浙江N2000色譜工作站。

1．2 試藥 檸檬苦素及諾米林對照品均購于四川維克奇生物科技有限公司(經(jīng)HPLC檢查純度大于98%)，所用試劑甲醇為色譜純，其余為分析純，重蒸水;炮制用橘核藥材購于成都荷花池藥材市場，所有藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥植與鑒定教研室裴瑾教授鑒定。

2 樣品制備

2．1 生橘核 取凈橘核適量，粉碎過三號篩備用。

2．2 清炒橘核 取凈橘核適量，依藥典2010年版附錄ⅡD清炒法進(jìn)行，得到清炒橘核，粉碎過三號篩備用。

2．3 麩炒橘核 取凈橘核適量，依藥典2010年版附錄ⅡD麩炒法進(jìn)行，得到麩炒橘核，粉碎過三號篩備用。

2．4 鹽炙橘核 取凈橘核適量，依藥典2010年版附錄ⅡD鹽炙法進(jìn)行，得到鹽炙橘核，粉碎過三號篩備用。另購市售鹽炙橘核四批，粉碎過三號篩備用。

3 方法與結(jié)果

3．1 色譜條件 色譜柱為迪馬C18(250 mm×4．6 mm);流動相:甲醇-水(65 ∶35);柱溫:室溫;體積流量:1．0 mL/min;檢測波長:210 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

3．2 對照品溶液的制備 精密稱取檸檬苦素對照品4．94mg和諾米林5．11mg，分別置于10 mL量瓶中，用色譜甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為母液備用。

3．3 樣品溶液制備 取橘核粉末0．5 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加30 mL石油醚(60～90℃)于70℃水浴回流脫脂4 h，過濾，棄去石油醚，殘?jiān)?0 mL二氯甲烷于50℃水浴回流提取1 h，過濾，取濾液將其放入蒸發(fā)皿中揮干，加色譜甲醇定容至10 mL，搖勻，過濾(0．45 μm 微孔濾膜)，取續(xù)濾液備用。

3．4 方法學(xué)研究

3．4．1 線性關(guān)系的考察 取一定量配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液稀釋，配制成一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得檸檬苦素和諾米林的質(zhì)量濃度分別為0．0494 mg/mL、0．0988 mg/mL、0．1976 mg/mL、0．3952 mg/mL、0．494 0 mg/mL 和 0．0511 mg/mL、0．1022 mg/mL、0．2044 mg/mL、0．3066 mg/mL、1．0220 mg/mL。按上述色譜條件進(jìn)樣10μL，得到以峰面積Y對檸檬苦素和諾米林濃度X(mg/mL)的線性回歸方程分別為 Y=3E+06X+72320，R2=0．9993 和 Y=3E+06X+99240，R2=0．9974。結(jié)果表明檸檬苦素在0．0494～0．4940 mg/mL 范圍內(nèi)，諾米林在 0．0511～1．0220 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3．4．2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液分別進(jìn)樣10μL，連續(xù)重復(fù)5次，以測得的檸檬苦素和諾米林的峰面積A為指標(biāo)，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以考察方法的精密度，求得檸檬苦素和諾米林RSD值分別為1．23%和0．89%，結(jié)果表明方法的精密度良好。

3．4．3 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批橘核藥材粉末0．5 g，5份，精密稱定，按3．3 項(xiàng)下制備，進(jìn)樣10 μL，以測得的檸檬苦素和諾米林的峰面積A為指標(biāo)，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以考察方法的重現(xiàn)性，求得檸檬苦素和諾米林RSD值分別為0．80%和1．16%。

3．4．4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取橘核藥材粉末0．5 g，精密稱定，按3．3 項(xiàng)下制備，于 0、2、4、8、12 h 各進(jìn)樣 10 μL，以測得的檸檬苦素和諾米林的峰面積A為指標(biāo)，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以考察供試品溶液的穩(wěn)定性，求得檸檬苦素和諾米林 RSD值分別為1．21%和1．92%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3．4．5 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取橘核藥材粉末5份，精密稱定，分別加入一定量檸檬苦素和諾米林對照品，按3．3項(xiàng)下制備并測定，計(jì)算檸檬苦素的平均回收率為99．92%，RSD值為1．27%(n=5)。諾米林的平均回收率為100．10%，RSD值為1．18%(n=5)。

3．5 樣品的測定 取各炮制品，按樣品溶液制備項(xiàng)下制備，進(jìn)樣10 μL，結(jié)果見表1，圖1、2。

表1 橘核生品及各種炮制品中檸檬苦素、諾米林測定結(jié)果(n=3)Tab．1 Cam parison of limonin and nom iln of different processed products of tangering seed

圖1 對照品檸檬苦素、諾米林的HPLC圖Fig．1 HPLC Chromatogram of limonin and nom ilin reference substance

圖2 橘核生品及各炮制品HPLC圖Fig．2 HPLC chromatogram of diffdrent processed products of tangerine seed

4 討論

4．1 不同炮制方法對橘核中檸檬苦素和諾米林的量均有顯著的影響。自制的各種炮制品與生品1比較，檸檬苦素和諾米林量均出現(xiàn)了不同程度的降低，尤其是鹽炙品和清炒品其檸檬苦素和諾米林總量僅分別為生品的72．5%、80%，但檸檬苦素與諾米林的比值變化不大。據(jù)文獻(xiàn)報道，溫度、pH值等是影響檸檬苦素類似物穩(wěn)定性的重要因素［11］，在炮制過程中橘核受熱，檸檬苦素和諾米林的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化轉(zhuǎn)化為其他檸檬苦素類物質(zhì)導(dǎo)致其量降低。由于鹽炙、清炒是直接受熱，故量降低最多，麩炒由于麥麩的隔熱作用，降低較少。

4．2 3個批次橘核生品中檸檬苦素和諾米林的總量均高于1%，且相差不大，但檸檬苦素與諾米林量的比值有較大差異(1．71 ～2．64)。

4．3 傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為橘核鹽炙過后會增強(qiáng)治療疝、乳腺腫痛的作用，也有現(xiàn)代研究報道鹽炙橘核較生品橘核的鎮(zhèn)痛抗炎作用更強(qiáng)［12］。課題組經(jīng)調(diào)查證實(shí)，目前臨床使用也以鹽橘核為主。但是本次實(shí)驗(yàn)表明，不同來源批次的鹽炙品檸檬苦素和諾米林的量有顯著差異(檸檬苦素與諾米林之和0．65% ～1．33%，檸檬苦素/諾米林之值 1．71 ～ 2．78)，為保證臨床用藥的安全有效，進(jìn)行中藥飲片的質(zhì)量控制勢在必行。

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