2010年北京市延慶縣首批流感病例樣的實驗室病原學檢測

北京市延慶縣疾病預防控制中心（102100）崔玉娟 任淑敏 蘇東霞

2010年11月2日，北京市延慶縣某小學出現了15例不明原因發熱癥狀兒童病患，主要臨床癥狀為發熱（體溫37.5℃以上）、咳嗽等。為查明疫情原因、制定有效的防治措施，及時控制、撲滅疫情并提供可靠的實驗室數據，本縣疾病預防控制中心應用實時熒光定量PCR技術對患者的咽拭子標本進行了甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、甲型H1N1流感病毒等亞型檢測。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 用帶有無菌聚丙烯纖維頭及聚丙烯桿的拭子采集發病3天內的病例咽拭子12份，于4℃保存下運送到實驗室進行檢測。

1.2 主要試劑與儀器 QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit、AgPath-IDTm onestep RT-PCR Kit（美國ABI公司）、引物（fluA、fluB、H1、H3、swfluA、swH1、RNP由北京市CDC 提供）、QIAGENQIAvac 24 Plus（德國QIAGEN公司）、離心機（德國Sigma公司）、生物安全柜（上海東聯）、AB 7500 fast PCR System（美國ABI公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本預處理 將12份咽拭子在渦旋振蕩器上充分震蕩混勻，室溫靜置10min。

1.3.2 核酸提取 分別取200μl預處理好的標本依照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒說明書進行核酸提取，最后分別得到60μl樣本核酸作為擴增模板。

1.3.3 核酸擴增 按照ABI公司的AgPath-IDTm one-step RTPCR Kit試劑盒說明書對12份核酸樣本進行real-time RT-PCR擴增。選擇FAM熒光檢測模式。

1.3.4 結果判斷 陰性對照：無擴增曲線，無CT值或0。陽性對照：有擴增曲線，CT值＜30。檢測樣本：樣本有典型的擴增曲線且CT值≤37，報告樣本陽性。見附表1。

2 結果

12份病例樣本完成PCR擴增后，其擴增曲線顯示：8份樣本為fluA、RNP及H3同時陽性，1份樣本七種引物探針核酸擴增均陰性，3份樣本僅RNP引物探針核酸擴增陽性。見附表2、附圖。

3 討論

Real-time RT-PCR是將熒光共振能量轉移技術（fluorescence resonance energy transfer，FRET） 應用于常規PCR儀中，通過受體發色團之間偶極與偶極相互作用，能量從供體發色團轉移到受體發色團，受體熒光染料發射出的熒光訊號強度與DNA或RNA產量成正比，檢測PCR過程的熒光訊號便可得知靶序列初始濃度，從而達到定量目的[1][2]。實時熒光定量PCR技術于1995年由美國PE公司推出后，Heid[3]等首先就其原理方法進行了報道。該方法具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、PCR污染少、快速簡潔、自動化程度高等優點[4]，可在3～4h內得到擴增結果。目前已在動植物基因工程、微生物和醫學領域中得到廣泛應用[5]，已經成為基層實驗室快速檢驗的重要手段。

附表1 結果判斷原則

附表2 12份病例樣本PCR擴增結果

附圖 12份樣本的real time RT-RCR擴增曲線

在流感樣的實驗室病原學檢測中，本研究利用fluA、fluB、H1、H3、swfluA、swH1等6種引物探針來實現對流感的分型分析。研究中還引入RNP引物探針作為內標，檢測人細胞中的RnaseP基因，從而判斷樣本采集及核酸提取是否合格。只有在采集的樣本合格的前提下，才能進一步分析得知。12份病例樣本的核酸擴增結果顯示，1號樣本RNP擴增結果為陰性，說明這份樣本并未采集到患者的咽部上皮細胞，為無意標本。因此，不能說明1號病例是否為流感病例。

同一起聚集性疫情中，病例的臨床癥狀相似，理論上其樣本的實驗室病原學檢測結果應該一致，但實際上有時會有差異。跟樣本采集的質量有關，若沒有采集到病例的咽部上皮細胞，則會得到陰性檢測結果；跟采樣的時間也有密切的關系，應在病例發病后盡早采集，一般采集發病3日內的標本。此外，由于RNA不穩定，極易降解，采集到的標本應在4℃下立即送達實驗室檢測，如不能立即檢測的標本應在-20℃或-80℃下冷凍保存。臨床標本運輸和儲存過程中應避免反復凍融，若標本運輸保存不當，則會影響檢測結果的準確性。擴增試劑的靈敏度也是影響檢測結果的一個重要因素，不同的檢測試劑盒其引物探針的靈敏度不同，最后所得到的檢測結果也會有一定差別。