比色法測定復方氨基酸注射液中胱氨酸含量

天津市武清區藥品檢驗所（301700）趙剛

復方氨基酸注射液（18AA）收載在《中華人民共和國衛生部藥品標準》（二部）第六冊（生化藥品第一分冊）中[1]。該標準無含量測定要求。同時，由于處方中胱氨酸的含量較低（兩種規格分別含胱氨酸0.01%和0.024%），目前多采用的柱前衍生化反相高效液相色譜法無法測定或誤差較大。為了全面控制該制劑的質量，筆者參考有關文獻[2][3]，建立了分光光度法測定其中胱氨酸含量的方法，有較好專屬性和準確度，現報道如下：

1 儀器與試藥

日本島津UV-2450型紫外-可見分光光度儀；L-胱氨酸對照品為日本產品，純度為99.8%；1,4-二硫代蘇糖醇為美國SERVAFEINBIOCHEMICA hEIDELBERG生產的生化試劑；氫氧化鈉、茚三酮、冰醋酸、鹽酸等均為分析純化學試劑。復方氨基酸注射液（18AA）均為國產制劑，規格為5%和12%。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 二硫代蘇糖醇溶液 取1,4-二硫代蘇醇約40mg置25ml量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.1.2 對照品儲備液 取經五氧化二磷減壓干燥4小時的L-胱氨酸對照品約30mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.1.3 酸性茚三酮溶液 取茚三酮0.25g，加冰醋酸6ml與鹽酸4ml，超聲振蕩使溶解，即得。本液須臨用新制。

2.1.4 陰性對照溶液 按處方量配制不含胱氨酸的溶液，精密量取該溶液0.5ml，精密加10mol/L氫氧化鈉溶液10μl，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液適量使對酚酞指示液恰顯粉紅色為止，再精密加入二硫代蘇糖醇溶液0.5ml，用水準確稀釋至2ml，搖勻，在室溫下放置30分鐘后，精密量取1ml，以此作為陰性對照溶液。

2.1.5 樣品溶液 精密量取復方氨基酸注射液（18AA）適量（約含胱氨酸0.04mg～0.06mg）用水稀釋至0.5ml，依照“2.1.4”項下自“精密加10mol/L氫氧化鈉溶液10μl”起同法操作，以此作為樣品溶液。

2.2 線性試驗 分別精密量取對照品儲備液0、0.025、0.05、0.15、0.25、0.35、0.45和0.50ml，用水稀釋至0.5ml，作為系列對照溶液。于上述各溶液中分別精密加入10mol/L氫氧化鈉溶液10μl，加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液適量使對酚酞指示液恰顯粉紅色，再精密加入二硫代蘇糖醇溶液0.5ml，用水準確稀釋至2ml，搖勻，在室溫下放置30分鐘后，分別精密量取1ml，置25ml具塞試管底部，于各個試管中精密加入冰醋酸與酸性茚三酮溶液1ml，輕輕搖勻，密塞，在水浴上準確加熱10分鐘后，立即冷卻，分別精密加入乙醇15ml，搖勻，以未加對照品儲備液的試液作為空白溶液。

在558nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得出線性方程為A=1.91×10-3+5.81C（r=0.998）。結果表明，胱氨酸在0～0.08mg/ml范圍內呈良好線性關系。

2.3 測定方法 精密量取樣品溶液1ml，依照“2.2”項下自“置25ml具塞試管底部”起同法操作，將測定結果代入標準曲線，計算注射液中胱氨酸的含量。不同廠家的測定結果見附表。

2.4 顯色溶液的穩定性 取已反應完畢的供試液在558nm波長處測定吸光度，每隔5分鐘測定一次，共考察25分鐘。結果在20分鐘內，含量測定結果下降了約2%，符合儀器分析的實驗誤差要求。

附表 含量測定結果

2.5 回收率試驗 依照“2.1.2”項下的方法配制對照品儲備液，分別精密量取對照品儲備液0.28、0.35、0.42ml各3份（不同溶液中約含胱氨酸分別為測定量的80%、100%和120%），再分別置5ml具塞試管中，然后各加入按處方量配制不含胱氨酸的溶液0.5ml，按“2.2”項下自“于上述各溶液中分別精密加入10mol/L氫氧化鈉溶液10μl”起同法操作。高、中、低三種濃度的平均回收率為99.0%，RSD（n=9）為0.51%。

2.6 重復性試驗 取同一批樣品，分別依照“2.1.2”項下的方法重復測定6次，得RSD為1.10%。

3 討論

3.1 取顯色后的對照品溶液和供試品溶液在400～700nm波長范圍內掃描。結果表明，顯色后的溶液最大吸收波長為558nm。在此波長處測定空白溶液基本無干擾。故選擇558nm為測定波長。

3.2 陰性對照溶液與空白溶液的吸光度值及光譜均一致，故以空白溶液為本底作相應的扣除，不干擾測定結果。

3.3 不同生產廠家在生產復方氨基酸注射液（18AA）時添加的胱氨酸量可能存在較大的差異，如采用對照品比較法會引進誤差，而標準曲線法可以測定一定范圍內的胱氨酸含量。

3.4 根據測定結果和胱氨酸標示量，其含量限度可控制在為標示量70.00～130.0%。

3.5 在加入供試液（或對照液）時，應注意加至管底部，避免沾在試管壁上而影響結果的準確。