正交試驗優選復方葉下珠的水提制備工藝

汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院（512026）徐曉梅 譚本仁

順德順風藥業有限公司（528300）劉賢英

汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院（512026）許衛關

復方葉下珠由葉下珠、半邊蓮、半枝蓮、雞骨草、茵陳、丹參、柴胡等十六味藥組成，具有疏肝解郁，益氣健脾，抗乙肝病毒，改善肝功能，調節免疫機能等功效。主治急慢性肝炎、重癥肝炎、肝硬化、肝癌等疾病。實驗為優選復方葉下珠的最佳提取工藝，以君藥葉下珠所含沒食子酸含量為指標成分，以煎煮時間、加水量、醇沉濃度三個對提取物收率影響較大的條件為考察因素，按L9(34)正交表進行試驗，以優選出用于該制劑生產的最佳水提取工藝，從而更好地控制制劑質量，保證藥物療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國 Waters 高效液相色譜儀、高效液相色譜儀(waters1525泵、717 自動進樣器、2487 紫外檢測器)；液相色譜柱(Microsorb-MV10-5，C18，250 mm ×4.6 mm，5μm)

1.2 試藥 藥材：葉下珠、半邊蓮、半枝蓮、雞骨草、茵陳、丹參、柴胡等經鑒定為真品；沒食子酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110831-200302），水為重蒸水，試劑皆為分析純。

2 實驗方法

2.1 提取溶媒的選擇 復方葉下珠是由葉下珠、半邊蓮、半枝蓮、雞骨草等藥材組成的，其中活性作用比較明確的有葉下珠的沒食子酸，葉下珠素，半邊蓮的L-山梗菜堿、延胡索酸，半枝蓮的黃芩苷、原兒茶酸以及雞骨草的相思子堿、黃酮苷等成分，經多次預試驗，確定在不違背中藥傳統提取工藝的前提下，為充分提高藥材的生物提出利用率，本品采用水作為溶媒進行提取。具體提取條件采用正交試驗方法進行優選。

2.2 正交試驗設計 試驗以復方葉下珠中葉下珠沒食子酸含量為標準，對煎煮時間、加水量、醇沉濃度三個因素進行考察，每因素設置三個水平，設計正交試驗（見附表1），從而選取最佳的水提工藝。

2.3 沒食子酸含量測定

通過試驗預試結果和參考文獻[1]，采用高效液相色譜法測定樣品中沒食子酸含量，測定方法經驗證可行。

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Microsorb-MV10-5，C18柱（250mm×4.6mm，5μm)；檢測波長280nm；流動相：甲醇-水-磷酸（4：96：0.05）；流速1ml/min；柱溫：室溫。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取減壓干燥直恒重的沒食子酸對照品約4mg，置10ml的容量瓶中，加30%甲醇溶解并定容配成濃度約為0.4mg/ml的溶液，即得。

2.3.3 標準曲線的制備 精密吸取標準溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5ml，用30%甲醉溶液定容至5ml容量瓶中，分別吸取20μl進樣，測定色譜峰面積。以色譜峰面積A為縱坐標，沒食子酸對照品的濃度為橫坐標，得回歸方程 Y=31558X十3677.1（r=0.9994），線性范圍為40～200μg/ml，可用外標一點法計算含量。

2.3.4 供試品溶液的制備及供試品測定 分別按處方比例稱取9份復方葉下珠中葉下珠、半邊蓮、半枝蓮、雞骨草等藥材，合計每份總重245g，根據附表1正交試驗因素水平，按以下工藝提取：葉下珠、半邊蓮、半枝蓮、雞骨草等十多種中藥材→加水煎煮→濃縮→酒沉→回收乙醇至流浸膏。精密稱取樣品約0.5ml，置50ml量瓶中，加甲醇30ml振蕩溶解，用甲醇稀釋置刻度，搖勻，過濾，取續濾液即得。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，注入液相色譜儀，測定計算沒食子酸含量。

附表1 正交試驗因素水平

3 結果

選用L9(34)正交試驗表設計，測定煎液中沒食子酸的含量，計算其提取量。試驗結果見附表2。

由附表2中數據直觀和方差分析可知，對于樣品中的沒食子酸提取得率來說，A、B、C因素對試驗均有顯著影響，影響因素為A>B>C。

附表2 方差分析

綜合試驗結果及實際操作問題，確定提取工藝為A2B2C3，即加水10倍，煎煮1小時，醇沉濃度為60%。

按照上述最佳提取工藝，按處方量稱取3份本品中各中藥材，合計每份總重735g，試驗結果表明該提取工藝下沒食子酸提取得率最高，且3批數據接近，說明該工藝穩定、可靠，達到了提取條件優化的目的。

4 討論

復方葉下珠以葉下珠和半邊蓮為君藥。葉下珠的主要有效成分為沒食子酸、葉下珠素。其中，沒食子酸有抗HSV活性，能抑制HSV對靶細胞的吸附[2]。葉下珠素能明顯降低ALT、AST水平，對CCl4和氨基半乳糖誘發的肝細胞損傷有明顯保護作用[3]。半邊蓮的主要有效成分為山梗菜堿、延胡索酸等具有明顯的利膽消炎及抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的作用[4]。

上述有效成分既易溶于水，又易溶于乙醇，為保持該藥的特點，發揮中藥的復方功效，故在制備工藝上采用水提醇沉法，采用葉下珠中主要活性成分沒食子酸提取得率作為指標，通過正交試驗用以優選最佳提取工藝。正交試驗結果表明，復方葉下珠的最佳提取工藝為加水10倍，煎煮1小時，醇沉濃度為60%。