抗生素微生物檢定二劑量管碟法常用菌種培養(yǎng)的研究

北京市豐臺(tái)區(qū)藥品檢驗(yàn)所(100071) 李婧 杜娟 陳征

中國(guó)是抗生素使用大國(guó)，也是抗生素生產(chǎn)大國(guó)。

1 抗生素微生物檢定法的概述

抗生素是微生物在代謝中產(chǎn)生的具有抑制它種微生物生長(zhǎng)活動(dòng)、甚至殺滅它種微生物的化學(xué)物質(zhì)?？股匚⑸餀z定法是測(cè)定抗生素效價(jià)的基本方法。是在適宜的條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線(xiàn)原理設(shè)計(jì)，通過(guò)檢測(cè)抗生素對(duì)微生物的抑制作用，計(jì)算抗生素活性（效價(jià)）的方法。藥典中規(guī)定的抗生素微生物檢定包括兩種方法，管碟法和濁度法。其中，管碟法是目前使用較多的方法。

管碟法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對(duì)接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈的大小，以測(cè)定供試品效價(jià)的一種方法。管碟法分為二劑量法和三劑量法。二劑量法是目前使用較多的方法。對(duì)于二劑量管碟法的準(zhǔn)確性很重要的一個(gè)影響因素就是實(shí)驗(yàn)菌，本文對(duì)實(shí)驗(yàn)菌種的培養(yǎng)進(jìn)行討論。

2 二劑量法管碟法操作步驟

2.1 菌種培養(yǎng)基本操作

2.1.1 菌種凍干粉的復(fù)狀 取凍干粉一支，加營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基約0.5ml，將菌粉溶解后，轉(zhuǎn)移至9ml肉湯培養(yǎng)基中，用刻度管吹洗數(shù)次后，放入培養(yǎng)箱中，在各菌種相應(yīng)的溫度下培養(yǎng) 20～24小時(shí)。為保證菌種的質(zhì)量，營(yíng)養(yǎng)肉湯菌液需在24小時(shí)內(nèi)使用。

2.1.2 菌種傳代 用接種環(huán)蘸取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基一環(huán)，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上均勻劃“之”字，然后放入培養(yǎng)箱中，在各菌種相應(yīng)的溫度下培養(yǎng) 20小時(shí)～24小時(shí)。菌種斜面需每月傳代一次，以保證菌種的良好狀態(tài)。

2.1.3 科氏瓶培養(yǎng) 使用芽孢的菌種，需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，且芽孢菌液可以保存較長(zhǎng)時(shí)間，所以可以采用科氏瓶培養(yǎng)，以便得到更多高濃度的菌液。

根據(jù)菌種斜面的成長(zhǎng)狀況，選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的3～5支，每支斜面分別用約1ml滅菌水將菌苔洗下，并轉(zhuǎn)移至同一個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂科氏瓶中，然后放入培養(yǎng)箱中，在各菌種相應(yīng)的溫度下培養(yǎng)7天。

在進(jìn)行科氏瓶培養(yǎng)時(shí)，科氏瓶中培養(yǎng)基應(yīng)向上放置，并墊高瓶口使科氏瓶稍稍?xún)A斜，使多余的水沉至瓶底，防止水分過(guò)多影響菌種的生長(zhǎng)。

2.1.4 菌液的制備 向培養(yǎng)好的斜面或科氏瓶中加入1～10ml滅菌水（或生理鹽水），將菌層洗下，轉(zhuǎn)移至經(jīng)過(guò)滅菌處理的試管中，使用芽孢的菌種需要在70℃水浴中保溫30分鐘進(jìn)行滅活后備用。

2.1.5 抗生素微生物檢定法常用菌種的培養(yǎng)條件 見(jiàn)附表。

2.2 菌種涂片的制備方法

2.2.1 涂片 涂片的整個(gè)操作過(guò)程需在酒精燈無(wú)菌圈內(nèi)進(jìn)行。首先點(diǎn)燃酒精燈，將接種環(huán)在酒精燈外焰下充分加熱滅菌，放涼，蘸取滅菌過(guò)的生理鹽水一環(huán)置一張經(jīng)滅菌的顯微載玻片上。再將接種環(huán)用酒精燈外焰加熱滅菌后，放涼，蘸取搖勻的菌液一環(huán)，涂置上述載玻片上的生理鹽水上，使菌液稀釋并涂抹均勻。然后將涂抹均勻的菌液時(shí)時(shí)置酒精燈火焰上加熱，是菌液蛋白質(zhì)凝固，待菌液干燥凝固之后涂片即制作完成。

2.2.2 染色 ①結(jié)晶紫染色。在片子上的菌膜處滴一滴結(jié)晶紫染色液，計(jì)時(shí)放置一分鐘，使染色液充分染色。②沖洗。待一分鐘計(jì)時(shí)結(jié)束，用純化水沖掉染色液。沖洗時(shí)注意，將涂片傾斜，自上而下沖洗。不能直接沖菌膜，否則可能導(dǎo)致菌膜固定不牢被沖掉。沖掉染色液后將片子晾干再進(jìn)行下一步操作。③復(fù)染。在片子的菌膜處滴加一滴革蘭氏碘液，計(jì)時(shí)放置一分鐘，目的在于固定蛋白質(zhì)與結(jié)晶紫的結(jié)合。④沖洗。待一分鐘結(jié)束后及時(shí)用純化水沖洗掉復(fù)染液，并晾干。方法同第二步。⑤脫色。在片子的菌膜處滴加酒精一滴，環(huán)東片子，使染色劑顏色脫落。一般脫色進(jìn)行30秒即可，也可根據(jù)脫色的情況而定，至洗脫染色液的顏色，但時(shí)間不宜太長(zhǎng)。⑥沖洗。待一分鐘及時(shí)結(jié)束后用純化水沖洗掉復(fù)染液，并晾干。方法同第二步。

2.2.3 常用菌種的形態(tài) 包括枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、肺炎克雷伯菌。見(jiàn)附圖1，2，3，4，5。

附表 抗生素微生物檢定法常用菌種的培養(yǎng)條件

2.3 雙碟的制備 取直徑約90mm、高16～17mm的平底雙碟，分別注入各品種抗生素標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定項(xiàng)下經(jīng)過(guò)滅菌處理的熱培養(yǎng)基20ml，使其在碟底均勻攤布，將加好培養(yǎng)基的碟子放置在事先調(diào)整水平的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使碟內(nèi)的培養(yǎng)基冷卻凝固并保持水平。另取相應(yīng)經(jīng)過(guò)滅菌處理的熱培養(yǎng)基適量，用水浴放冷至適當(dāng)溫度，然后加入相應(yīng)的試驗(yàn)菌，加菌量需要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，使標(biāo)準(zhǔn)品溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18～22mm，搖勻后，在每一個(gè)鋪好底層的碟子中加入5ml的帶菌培養(yǎng)基，使其均勻攤布，放置在水平臺(tái)上，冷卻使培養(yǎng)基凝固，放置時(shí)間應(yīng)不少于20分鐘。然后在每一雙碟中以等距離均勻放置4個(gè)不銹鋼小管，鋼管大小為內(nèi)徑6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外徑7.8±0.1mm，用陶瓦罐覆蓋備用。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液的制備 按照各品種抗生素標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，配制標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液，使其濃度為1000單位/ml，然后按照《中國(guó)藥典》規(guī)定的各品種抗生素使用的緩沖液，將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液分步稀釋至合適的兩個(gè)濃度，高、低濃度的比例為2:1或4:1[1]。

2.5 滴加樣品 配制好合適濃度的供試品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液后，按照SH、TH、TL、SL的順序，向制備好的雙碟中加入供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每批樣品的雙碟數(shù)量至少為4個(gè)。最后放入培養(yǎng)箱中，在合適的溫度下培養(yǎng)。

2.6 結(jié)果判定 雙碟經(jīng)過(guò)適宜的培養(yǎng)后，會(huì)產(chǎn)生4個(gè)抑菌圈，根據(jù)準(zhǔn)品和供試品溶液產(chǎn)生抑菌圈的大小，可計(jì)算得出供試品的效價(jià)。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，要對(duì)參與計(jì)算的所有碟子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性測(cè)驗(yàn)和可信限的計(jì)算，在P>0.05，可信限率不大于5%的情況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才是有效的。

3 菌種對(duì)抗生素微生物檢定結(jié)果的影響

附圖1 枯草芽孢桿菌

附圖2 短小芽孢桿菌

在抗生素微生物檢定法的結(jié)果判定中，最主要的數(shù)據(jù)是抑菌圈的大小。影響抑菌圈大小的因素有很多，如抗生素的濃度，抗生素對(duì)試驗(yàn)菌的敏感程度，培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)溫度，菌種的生長(zhǎng)活力，菌液濃度等。諸多因素中，菌種的影響是比較大的。菌種的形態(tài)和活性，菌齡、菌液的濃度等都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。所以菌種培養(yǎng)的每一步都是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，為保證實(shí)驗(yàn)菌的狀態(tài)良好，還應(yīng)做涂片，在顯微鏡下觀(guān)察菌種形態(tài)。

3.1 菌種形態(tài)、活力和菌齡的影響 ①菌種的形態(tài)不典型、活力不強(qiáng)或者菌齡過(guò)大會(huì)直接影響到抑菌圈的形態(tài)。②菌種的形態(tài)不佳，與典型菌種形態(tài)差異較大，或菌種活力不強(qiáng)，在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)稀疏。制成菌液后可能會(huì)造成對(duì)抗生素活力不夠，長(zhǎng)出過(guò)大的抑菌圈，也可能會(huì)造成菌對(duì)抗生素不敏感，長(zhǎng)出過(guò)小、甚至長(zhǎng)不出抑菌圈。③菌齡過(guò)大就會(huì)使菌液中的代數(shù)過(guò)多，由于每代菌的活力不同，新生菌活力強(qiáng)，老代的菌相對(duì)活力較弱，在進(jìn)行抗生素微生物檢定法時(shí)會(huì)長(zhǎng)出雙圈或者抑菌圈的邊緣不清晰，這種情況下不能應(yīng)用儀器測(cè)量。

3.2 菌液濃度的影響 菌液的濃度在《中國(guó)藥典》上有具體的規(guī)定，這是因?yàn)椴煌N類(lèi)的抗生素對(duì)敏感菌的抑菌效力是不同的。同樣濃度的菌液，加入這種抗生素中能長(zhǎng)出大小合適的圈，但是換另一種抗生素可能就不能長(zhǎng)出大小適宜，甚至不能長(zhǎng)出抑菌圈。所以，菌液的濃度是靠檢驗(yàn)員在每次正式實(shí)驗(yàn)之前通過(guò)預(yù)試，測(cè)定幾種不同濃度的菌液，通過(guò)預(yù)試結(jié)果總結(jié)出的一個(gè)最合適的濃度，因此，在此不能一概而論。

附圖3 金黃色葡萄球菌

附圖4 藤黃微球菌

附圖5 肺炎克雷伯菌