高效液相色譜法測定銀芩膠囊中黃芩苷的含量

湖南省衡陽市中心醫院（421001）顏瀅

湖南省南華大學附一醫院（421001）李卓

銀芩膠囊是由金銀花、黃芩、魚腥草、散去葉合理配方所制成的硬膠囊劑，其內容物為黃色至黃褐色顆粒和粉末，氣微，味苦。本品具有清熱解毒，清宣風熱之功效，用于外感風熱所致的發熱、咳嗽、咽痛及呼吸道感染見以上癥狀者[1]。本品尚未收載入《中國藥典》，為了有效控制藥品質量，確保該制劑的療效，本文以方中主藥黃芩的有效成分黃芩苷為定量控制指標，采用高效液相色譜法（HPLC）測定銀芩膠囊中黃芩苷的含量，方法簡便、準確，現報告如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津SPD-10AVP高效液相色譜儀，包括LC-10ATVP-一元高壓泵，SPD-10AVP紫外檢測器，CTO-10ASVP柱溫箱，S C L-1 0 A V P 系統控制器；LibrorAEG-200電子天平(日本島津制造所)；Millipore simplicity-185超純水器(美國密理博公司)；LS-3120 超聲波發生器(美國科學系統公司)；RE- 52A 旋轉蒸發器(上海青浦滬西儀器廠)。

1.2 試藥 甲醇(色譜純) ；磷酸(分析純) ；四氫呋喃(分析純) ；黃芩苷對照品(由中國藥品生物制品檢定所提供，批號為110715-200815，含量測定用) ；銀芩膠囊(昆明制藥集團股份有限公司生產，批號090611、091121和091125)及其空白樣品由某有限責任公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[2～5]色譜柱：大連依利特C18柱( 250mm×4mm, 10μm) ；流動相:甲醇- 磷酸- 四氫呋喃( THF) ( 45: 55: 6) (磷酸為pH=2.7 的磷酸水溶液)；流速:1ml/min；柱溫:25℃；檢測器波長:280nm。

2.2 系統試用性試驗 按供試品含量測定項下方法制備對照品溶液, 取該對照品溶液、供試品溶液各20μl, 注入液相色譜儀。理論塔板數以黃芩苷計, 理論板數n=3.54(tR／Wh/2)2=3486，說明在選定的條件下，色譜柱的某些條件如柱長、載體性能及色譜柱填充均符合要求，測定效果良好；分離度R>1.5。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷對照品(60℃減壓干燥至恒重) 3.7mg，置于100ml容量瓶中，加20ml甲醇超聲20min，完全溶解后加水至刻度，0.45μm的濾膜過濾制成對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取銀芩膠囊3盒，每盒隨機取10粒，除去膠囊殼，取本品膠囊內容物約2.5g，精密稱定，置50mL量瓶中，加甲醇45mL，超聲處理40min，放冷后，甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，經0.45μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.3”項下的對照品溶液1ml、2ml、4ml、6ml、8ml 與10ml容量瓶中，70%甲醇定容，混勻。各精密進樣20μl，測得峰面積，以峰面積對濃度(μg/ml) 進行線性回歸，結果表明在3.7～29.6μg/ml的濃度范圍內，線性關系良好。標準曲線為: Y=57417x- 31303，γ=0.9998。

2.6 進樣精密度試驗 取“2.3”項下對照品溶液5ml置于10ml 的容量瓶中，70% 的甲醇定容至10ml，經過0.45μm 的微孔濾膜過濾，濾液重復進樣5次，每次進樣20μl，依據測定結果計算RSD為0.67%( n=5) ，小于2.0%，符合要求。

2.7 穩定性試驗 取“2.3”、“2.4”項下對照品溶液，供試品溶液，分別在0、2、4、12、24h時注入液相色譜儀中測定，測得黃芩苷的相對標準偏差分別為1.5%、2.3%，說明對照品溶液、供試品溶液在24h內穩定。

2.8 重現性試驗 精密吸取樣品批號為091106的銀芩膠囊，按“2.4”項下的方法制備5份，分別進樣20μl，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，測得黃芩苷平均含量為3.19mg/ml，RSD=1.6%(n=5) ，說明本方法重現性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號090611），精密吸取6 份，分別加入一定量的黃芩苷對照品，按“2.4”項下方法制備，并按“2.1”項下的色譜條件進行測定，試驗結果見附表1。

2.10 樣品含量測定 精密吸取按“2.4”項下的方法制備的供試品溶液各20μl，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，4批供試品含量測定結果詳見附表2。

附表1 加樣回收率試驗結果（n=6）

附表2 樣品含量測定結果（n=5）

3 討論

3.1 在流動相選擇方面，通過調節比較水和甲醇的比例，溶液的pH 值、流動相中TPF的含量等幾方面，以獲取最佳的分析條件。經過多次實驗，得出如下結論：①增加甲醇比例，增加洗脫能力，減小保留時間，但是理論塔板數就會減小，不能達到要求，并使樣品的峰分離不完全。②水相的比例增加，作用和甲醇相反，增加比例就會使理論塔板數增大，但是當比例達到65%以后，保留時間遠大于20min，故不宜采用。③因為實驗所用高效液相色譜柱的pH適用范圍是2～8，酸性太強和堿性太強，易使柱內填料變性，致使柱效降低，為保證柱效采取磷酸溶液調節純化水到pH 值為2.7。④流動相中加入適量的四氫呋喃可改善峰型，使理論塔板數增大，最終確定流動相為甲醇-磷酸-四氫呋喃（45: 55: 6），能保證分離效果好，出峰時間短，柱效高。

3.2 取質量濃度為10μg/mL 的對照品溶液，在200～400nm波長范圍內進行紫外掃描，結果在280nm 波長處有最大吸收，故以280nm為檢測波長。

3.3 該方法簡便易行、準確度高、被測溶液穩定，可作為銀芩膠囊中黃芩苷的含量測定方法來對銀芩膠囊進行質量控制。