慢性乙型肝炎患者196例病毒基因分型與臨床的關(guān)系

付建軍，白艷麗，王巧俠，趙怡生，趙英仁，李建元 (西安市中心醫(yī)院感染科，西安 710003;通訊作者，E-mail:fjianj@163.com)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界范圍廣泛流行，不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大。目前我國(guó)現(xiàn)有慢性HBV感染者約9 300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬(wàn)人［1］。依據(jù)郭霍氏原則(Koch’s postulate)，微生物本身是造成疾病的一個(gè)決定因素，從遺傳角度而言，基因本身又決定了微生物的眾多生物行為。因此不同基因型的HBV也會(huì)有不同的生物學(xué)特征如致病性或?qū)共《舅幬镏委煹姆磻?yīng)等。目前根據(jù)HBV全基因組核苷酸序列的異質(zhì)性≥8%或S區(qū)核苷酸序列異質(zhì)性≥4%的標(biāo)準(zhǔn)，將 HBV分為9個(gè)基因型即 AI［2，3］。HBV基因型具有一定地理區(qū)域性分布特征，而陜西又是一個(gè)慢性乙型肝炎高發(fā)區(qū)，為此我們采用巢式PCR法檢測(cè)西安市中心醫(yī)院感染科診治的慢性乙肝患者HBV基因型，以了解其分布特點(diǎn)及其與患者臨床特征的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 196例慢性乙型肝炎患者為2007－07～2007－12在我院感染科住院或門(mén)診就診的患者，且經(jīng)熒光PCR法檢測(cè)HBV-DNA呈陽(yáng)性結(jié)果。其中男性131例，女性65例，年齡8－70歲，平均(33.7±18.6)歲，慢性乙型肝炎的診斷符合 2005年慢性乙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。排除合并有其他病毒感染如丙型肝炎病毒、HIV、庚型肝炎病毒，甲型肝炎病毒等，排除藥物性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝病等。

1.2 標(biāo)本采集 由專人抽取患者清晨空腹靜脈血2 ml，分離血清0.2 ml，置 －20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HBV DNA的提取 取100 μl血清加入蛋白酶K及其緩沖液200 μl混勻，57℃水溶1 h，95℃水溶10 min，滅活蛋酶 K后，酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)提取 DNA，等體積氯仿再次提取 DNA，2.5倍體積無(wú)水乙醇沉濾過(guò)夜，700 ml/L酒精洗滌晾干，加入20 μl蒸餾水或TE液溶解，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HBV基因分型 應(yīng)用巢式多引物多聚酶鏈反應(yīng)，引物由上海生工生物公司合成。外引物:上游引物序列5'－AGC ATG GGA GGT TGG TCG TC－3'，下游引物序列5'－AIG GCA TCA AGG CAG GAT AGC－3'。內(nèi)引物:上游引物序列5'－GGC TCA AGT TCC GGA ACA GT－3';A基因型特異性下游引物5'－CTC GCG GAG ATT GAC GAG ATG T－3'，B基因型特異性下游引物5'－CAG GTT GGT GAG TGA CTG GAG A－3'，C基因型特異性下游引物5'－GGT CCT AGG AAT CCT GAT GTT G－3'。

外引物擴(kuò)增PCR程序參數(shù)如下:94℃ 1 min預(yù)變性，94℃ 90 s變性，59℃ 90 s退火，72℃ 2 min延伸，共30個(gè)循環(huán)，72℃ 延長(zhǎng)10 min。內(nèi)引物擴(kuò)增程序參數(shù)如下:94℃ 1 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，58℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，共35個(gè)循環(huán)。NTPCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L(1.5%)瓊脂糖凝膠電泳后判斷HBV基因型:281 bp為B基因型，122 bp為C基因型，同時(shí)有122 bp和281 bp者為B/C混合型。

1.5 HBV DNA定量檢測(cè) 采用熒光定量PCR法，HBV DNA提取按操作說(shuō)明。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用±sˉx，計(jì)數(shù)資料率的比較采用 χ2檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-test，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性HBV不同基因型的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果及慢性HBV的基因型分布 根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果確定基因型見(jiàn)圖1。196例患者中C基因型138例(70.4%)，B 基因型40 例(20.4%)，B/C 混合型18例(9.2%)。未檢測(cè)到其他基因型，提示西安市中心醫(yī)院感染科診治的慢性HBV感染者的優(yōu)勢(shì)基因型為C型，其次為B型，B/C混合型所占比例最少。

圖1 特異性引物巢式PCR電泳基因分型結(jié)果Fig 1 The results of HBV genotype by nested PCR with genotype-specific primers

2.2 慢性HBV感染者不同性別的基因型分布情況本組資料中男性131例，女性65例，在各基因型中男性患者所占比例均大于女性患者，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。提示基因型分布在不同性別無(wú)明顯差異。慢性HBV感染者不同性別的基因型分布情況見(jiàn)表1。

表1 慢性HBV感染者不同性別的基因型分布 例(%)Tab 1 The correlation of HBV genotype with the sex in patients with chronic infection cases(%)

2.3 慢性HBV感染者基因型分布與臨床病情的關(guān)系 慢性HBV感染者基因型分布與臨床病情的關(guān)系見(jiàn)表2。基因C型在不同病情患者組中所占的比例較多，但經(jīng)對(duì)慢性乙肝組及不良結(jié)局組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.969，P＞0.05)。提示患者不同的臨床病情與慢性乙肝病毒的基因型分布無(wú)相關(guān)性。

表2 慢性HBV感染者基因型分布與臨床病情的關(guān)系Tab 2 The correlation of HBV genotype with disease severity in patients with chronic infection

2.4 慢性乙肝HBV基因型與HBeAg的關(guān)系 慢性乙肝患者中HBeAg(+)所占的比例高于HBeAg(－)所占的比例，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.583，P＜0.05)。而 HBeAg(+)或 HBeAg(－)患者C基因型所占比例高于B基因型和B/C混合型，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示:HBeAg(+)、HBeAg(－)患者B、C 基因型分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.891，P＜0.05);而 HBeAg(+)、HBeAg(－)患者在基因 B 型與B/C混合型，基因C型與B/C混合型分布方面經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為χ2=3.535，P＞0.05;χ2=0.174，P＞0.05)。提示基因 C型患者HBeAg(+)陽(yáng)性率較B型高。慢性乙肝HBV基因型與HBeAg的關(guān)系見(jiàn)表3。

2.5 慢性乙肝HBV基因型分布與肝功轉(zhuǎn)氨酶、HBV-DNA載量的關(guān)系 肝功ALT、AST為非正態(tài)分布，統(tǒng)計(jì)描述采用非參檢驗(yàn)Kruskal-Test;HBV-DNA載量行方差分析。本研究資料顯示基因C型、B/C混合型患者的病毒載量高，說(shuō)明這兩型患者乙肝病毒復(fù)制水平高于基因B型患者，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;此外，3種基因型患者在ALT、AST分布差異上也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示各基因型分布在肝臟炎癥程度、HBV-DNA載量方面無(wú)差異。慢性乙肝HBV基因型分布與肝功轉(zhuǎn)氨酶、HBV-DNA載量的關(guān)系見(jiàn)表4。

表3 慢性乙肝HBV基因型與HBeAg的關(guān)系 例(%)Tab 3 The correlation of HBV genotype and HBeAg in patients with chronic infection cases(%)

表4 慢性乙肝HBV基因型分布與肝功轉(zhuǎn)氨酶及HBV-DNA載量關(guān)系Tab 4 The correlation of HBV genotype and the level of ALT and HBV-DNA in patients with chronic infection

3 討論

乙型肝炎病毒為一雙鏈DNA病毒，其遺傳變異性很高，自O(shè)kamoto等［5］首次提出HBV基因型后，為HBV的臨床與基礎(chǔ)研究開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。近年研究發(fā)現(xiàn)，HBV基因型的一個(gè)顯著特征是呈一定的地理區(qū)域性分布。在我國(guó)流行的HBV基因型主要為B型和C型，其中北方以C型為主，南方以B型多見(jiàn)［6］。本研究結(jié)果表明，西安市中心醫(yī)院感染科診治的慢性HBV基因型為C型，B型及B/C混合型，優(yōu)勢(shì)基因型為C型，與上述文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。

HBV感染人體后的臨床表現(xiàn)有顯著的個(gè)體差異，可分別表現(xiàn)為:一過(guò)性病毒血癥、急性肝炎、無(wú)癥狀的慢性病毒攜帶狀態(tài)、慢性肝炎、慢性肝衰竭、肝硬化及肝癌［7］。因此不同HBV基因型可以導(dǎo)致不同的臨床表現(xiàn)及預(yù)后。有研究報(bào)道，基因C型HBV感染者較B型感染者更易發(fā)展為肝硬化和肝癌［8－11］;另有研究報(bào)道，基因D型HBV感染者更易發(fā)生肝衰竭［12］，且基因D型感染者更易引起慢性乙肝病情復(fù)發(fā)［13］。本組資料也顯示基因C型患者較B型、B/C混合型患者而言，肝硬化、肝癌所占的比例較高，且在性別方面男性明顯多于女性，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，基因C型、B型、B/C混合型在臨床病情、性別方面，三種基因型間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能與我們?nèi)脒x不良結(jié)局組患者例數(shù)相對(duì)偏少，使其統(tǒng)計(jì)結(jié)果出現(xiàn)偏倚有關(guān)，也可能實(shí)際情況確實(shí)如此，這有待我們進(jìn)一步擴(kuò)大樣本深入研究。

有研究表明HBV不同基因型由于其基因結(jié)構(gòu)的差異可造成其致病性的差異，從而影響慢性乙肝患者病情發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、HBV標(biāo)志物的表達(dá)及對(duì)抗病毒藥物治療的療效［12，13］。本研究通過(guò)對(duì)基因型的分布與HBeAg狀態(tài)的分析發(fā)現(xiàn)，基因C型患者血清HBeAg陽(yáng)性率明顯高于基因B型患者，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種差異如實(shí)地反映了基因C型患者免疫耐受期較B型患者長(zhǎng)，HBeAg血清轉(zhuǎn)換率較B型患者低，預(yù)后較基因B型患者差。而基因C型與B/C混合型、基因B型與B/C混合型分布的差異與HBeAg的不同狀態(tài)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，本研究結(jié)果還顯示，在基因型分布與HBV-DNA載量方面，B/C混合型、C型患者HBV-DNA載量高于基因B型患者，表明B/C混合型、C型患者HBV復(fù)制較B型活躍，但不同基因型間HBV-DNA載量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外本研究結(jié)果顯示基因型分布與肝功轉(zhuǎn)氨酶異常間的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與文獻(xiàn)報(bào)道不一致［14］，其原因可能與我們?nèi)脒x的非活動(dòng)性攜帶者、慢性輕度乙肝患者及慢性重度乙肝患者肝功轉(zhuǎn)氨酶波動(dòng)范圍較大對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果造成影響有關(guān)。

此外本研究檢測(cè)到少量B/C混合基因型，其存在的原因可能與下列因素有關(guān):①重疊感染;②病毒變異或基因重組。我們通過(guò)對(duì)研究資料分析還發(fā)現(xiàn)在基因型的分布與HBV-DNA載量方面，B/C混合型HBV-DNA定量高于C型及B型。由于HBVDNA載量反映病毒復(fù)制水平并可預(yù)測(cè)抗病毒的療效。因此與單基因型相比，B/C混合型的致病性在HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換、抗病毒治療反應(yīng)及預(yù)后方面，目前研究較少，仍需對(duì)該型患者進(jìn)行進(jìn)一步研究和探討。

總之，西安市中心醫(yī)院感染科診治的慢性乙肝患者HBV基因型以C型和B型為主，同時(shí)還可檢測(cè)到少量B/C混合型。由于各基因依據(jù)HBV全基因序列異質(zhì)性≥4%且＜8%的原則又提出亞型概念;因此亞型與臨床的關(guān)系，基因型或亞型與抗病毒藥物長(zhǎng)期治療間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究和探討。

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