血清透明質酸在梗阻性黃疸肝損傷模型中的變化及其意義

梁 斌，任昌安，李文星，閻慧明，商中華，韓曙光 (中國人民解放軍總醫院肝膽外科醫院，全軍肝膽外科研究所，北京 00853;山西醫科大學第二臨床醫學院普通外科;通訊作者，E-mail:doctorlb@63.com)

梗阻性黃疸是指由于肝外膽管梗阻所致的膽汁淤積性疾病，可導致嚴重的全身性的病理生理改變［1］。研究顯示肝竇內皮細胞在肝臟微循環中具有重要的調節作用［2－5］，并具有吞噬清除、合成細胞外基質及脂質代謝等功能，在梗阻性黃疸肝臟損傷中起到重要作用［6，7］，而有關梗阻性黃疸時肝竇內皮細胞的損傷報道較少。本文動態觀察梗阻性黃疸后血清透明質酸變化及其與中性粒細胞聚集之間的關系，對肝竇內皮細胞的損傷及機制作深入探討。

1 材料與方法

1.1 實驗分組及模型制作 雄性健康Wistar大鼠60只，體重250－300 g，由山西醫科大學動物實驗中心提供。動物隨機分為:膽總管結扎組和假手術組(只游離膽總管但不結扎組)，每組各30只。膽總管結扎組根據術后不同的時間分為1 d，3 d，7 d，14 d，21 d 共 5 個小組，分別記為 OJ1，OJ3，0J7，OJ14，OJ21，每組6只。大鼠均常規喂養，術前12 h禁食，不禁水，采用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，備皮消毒后，取上腹正中縱切口，長約3 cm，尋找膽總管并于近肝門處0#絲線行三重結扎，在近端兩處和遠端一處間剪斷。假手術組只游離膽總管，不結扎離斷膽總管，與膽總管結扎組類似，按術后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d 不同時間點分為5 個小組，分別 SM1、SM3、SM7、SM14、SM21。各組在相應的時間點，經腹主動脈抽取血液，離心后將血清保存于－20℃冰箱待測;取血后，切取不同部位肝臟組織3塊，分別用于髓過氧化物酶測定、組織病理學檢測以及濕干比重測定。

1.2 儀器與試劑 分析天平、Olympus光學顯微鏡、722分光光度儀、NS-648型放射免疫γ計數器。透明質酸放射免疫測定盒(上海海研醫學生物技術中心)、肝臟組織髓過氧化物酶(MPO)、谷丙轉氨酶、血清總膽紅素、血清肌酐檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 血清透明質酸及其他血清學指標測定 血清透明質酸測定采用放射免疫法;血清谷丙轉氨酶:賴氏法;血清總膽紅素:固蘭B法;血清肌酐:苦味酸不除蛋白法。MPO測定:取冰凍新鮮肝臟組織樣本，制備成濃度為5%的組織勻漿，然后加入H2O2顯色劑，水浴后立即在460 nm處測定OD值。具體方法參照MPO測試盒說明。MPO活力以37℃反應體系中H2O2被分解1 μmol為1個活力單位。MPO活性(U/g)=(測定管 OD值－對照管 OD值)/11.3×取樣量。以上各指標的檢測均嚴格按照說明書進行操作。

1.4 組織病理學檢查 切取大鼠部分肝臟，經10%的中性甲醛固定24 h，常規石蠟包埋、切片、HE染色。在高倍鏡下(HPF×1 000)隨機取50個視野行雙盲法中性粒細胞計數，以評價其聚集程度。

1.5 肝臟組織濕干比 切取部分肝臟標本，置于55℃的烘箱內烘烤至少72 h或者至取得一恒定數值為止。肝臟組織濕干比=肝臟濕重/干燥后重量。1.6統計學分析所有數據均用±s表示，采用SPSS10.0軟件分析，采用One-way ANOVA進行方差齊性檢驗，組間比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 血清總膽紅素和谷丙轉氨酶 假手術組各時間點血清總膽紅素及血清谷丙轉氨酶之間沒有明顯變化(P＞0.05)，故未將SM各組數據列出，而將其作為一整體與OJ各組進行比較。與假手術組相比，膽總管結扎組血清總膽紅素于膽總管結扎后1 d即明顯增高(P＜0.01)，術后3 d達到高峰，其后保持在較高水平。膽總管結扎組血清谷丙轉氨酶于術后1 d即明顯增高(P＜0.01)，術后14 d血清谷丙轉氨酶有所下降，但仍明顯高于假手術組(P＜0.01)，見表1。

表1血清總膽紅素和谷丙轉氨酶的變化(±s)Tab 1 Changes of serum total bilirubin and serum alanine aminotransferase in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

表1血清總膽紅素和谷丙轉氨酶的變化(±s)Tab 1 Changes of serum total bilirubin and serum alanine aminotransferase in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

與假手術(SM)組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n T-BIL/(μmol/L) ALT(IU/L)SM組30 4.04 ±0.77 19.00 ±5.59 OJ1 組 6 96.80 ±3.41＊＊ 243.00 ±23.08＊＊OJ3 組 6 165.70 ±8.02＊＊ 84.02 ±7.37＊＊OJ7 組 6 154.00 ±11.62＊＊ 116.64 ±10.78＊＊OJ14 組 6 149.57 ±10.88＊＊ 63.14 ±8.60＊＊OJ21 組 6 139.65 ±9.38＊＊ 33.58 ±7.77*

2.2 血清透明質酸和肌酐 ①假手術組血清透明質酸于術后1 d均明顯高于該組術后其他時間(P＜0.01)，與膽總管結扎組相比較仍明顯減少(P＜0.05)，見表2。膽總管結扎組血清透明質酸在術后3 d及其后的時間均明顯高于相應的假手術組(P＜0.01)，術后 21 d 達到高峰(P＜0.01)，見表 2。②膽總管結扎組血清肌酐較假手術組增高明顯(P＜0.05)，其高峰出現在手術后第3天。膽總管結扎組和假手術組組內血清肌酐未見明顯變化(P＞0.05)，見表2。③膽總管結扎組血清透明質酸的增高早于血清肌酐的增高，且并未隨其發生相應變化。

經相關分析顯示膽總管結扎組血清透明質酸與血清肌酐變化之間無明顯相關性(Pearson相關系數r雙側=－0.036，P=0.849)。

2.3 肝臟組織髓過氧化物酶含量及濕干比 ①肝臟組織中髓過氧化物酶反映中性粒細胞在肝臟內的聚集程度。隨著手術時間延長，肝臟內中性粒細胞的聚集程度明顯增加，見表3。②肝臟濕干比的變化顯示膽總管結扎組較假手術組術后不同時間均有統計學差異，肝臟組織的水腫于21 d時達高峰，見表3。

表2血清透明質酸和肌酐的變化(±s，n=6)Tab 2 Changes of serum hyaluronic acid and serum creatinine in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

表2血清透明質酸和肌酐的變化(±s，n=6)Tab 2 Changes of serum hyaluronic acid and serum creatinine in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

同時間點與假手術組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;同組與術后1 d比較，##P ＜0.01

術后天數 HA/(ng/ml)SM組 OJ組Cr/(mmol/L)SM組 OJ組1 d 157.28 ±18.12 213.45 ±10.25* 1.49 ±0.23 2.07 ±0.15*3 d 78.99 ±9.24## 256.19 ±18.20＊＊ 1.29 ±0.05 2.51 ±0.24*7 d 83.03 ±9.44## 229.82 ±32.39＊＊ 1.24 ±0.08 2.33 ±0.20*14 d 71.87 ±15.78## 236.68 ±20.38＊＊ 1.28 ±0.11 2.32 ±0.13*21 d 88.25 ±16.82## 449.74 ±66.65＊＊## 1.26 ±0.20 2.25 ±0.12*

表3肝臟組織髓過氧化物酶和濕干比的變化(±s，n=6)Tab 3 Changes of myeloperoxidase in liver tissue and ratio of wet and dry weight of liver in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

表3肝臟組織髓過氧化物酶和濕干比的變化(±s，n=6)Tab 3 Changes of myeloperoxidase in liver tissue and ratio of wet and dry weight of liver in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s，n=6)

同時間點與假手術組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

術后天數 MPO(U/g)SM組 OJ組W/D SM組 OJ組1 d 0.57 ±0.08 0.87 ±0.05* 2.71 ±0.21 3.14 ±0.25*3 d 0.59 ±0.09 1.31 ±0.17＊＊ 2.81 ±0.16 3.12 ±0.04*7 d 0.61 ±0.09 1.44 ±0.16＊＊ 2.79 ±0.05 3.20 ±0.15*14 d 0.64 ±0.06 1.50 ±0.18＊＊ 2.66 ±0.12 3.27 ±0.11*21 d 0.60 ±0.08 1.62 ±0.19＊＊ 2.69 ±0.10 3.64 ±0.17*

2.4 光鏡觀察 ①HE染色:膽管梗阻急性期(術后1 d)可見肝臟充血水腫明顯;其后早期肝細胞濁腫，水樣變性或脂肪變性，肝細胞內少見膽色素顆粒，小膽管內不見膽栓形成，匯管區無明顯改變。隨梗阻時間延長，肝細胞變性較前為重，部分肝細胞壞死，肝細胞內可見膽色素沉著、枯否細胞增生、匯管區水腫、小膽管增生明顯，管腔內可見膽栓形成，匯管區可見明顯炎癥細胞浸潤及纖維組織增生。肝臟纖維化程度于術后21 d時肝臟纖維化最重。②假手術組各時間點肝組織內中性粒細胞聚集程度的差異無統計學意義(P＞0.05)，故未將SM各組數據列出，而將其作為一整體與OJ各組進行比較(見表4)。數據顯示膽總管結扎組術后1 d中性粒細胞數即有增高，隨著時間的延長膽總管結扎組中性粒細胞較假手術組明顯增高。

2.5 相關分析 膽總管結扎組血清透明質酸的變化分別與肝臟組織內髓過氧化物酶含量、中性粒細胞聚集程度呈正相關性(分別相關系數r=0.469，P=0.009，雙側;r=0.398，P=0.03，雙側)。

3 討論

梗阻性黃疸后肝臟微循環障礙涉及對肝竇內皮細胞功能的評價，近年的研究顯示通過血清透明質酸的變化可反映該細胞的功能改變［8，9］。血清透明質酸(hyaluronic acid，HA)是一種沒有支鏈結構的高分子量黏多糖，由間質細胞合成，廣泛存在于全身結締組織中，代謝產生的HA可經淋巴系統進入血液循環。肝竇內皮細胞表面有HA受體，是清除血液中HA的主要部位，血清中的HA可特異性地被肝竇內皮細胞攝取和降解［10］，少量小分子由腎小球濾過。因此，HA的改變可用以反映肝竇內皮細胞的功能，顯示肝臟微循環損傷狀況［11］。

表4肝組織內中性粒細胞聚集程度(±s)Tab 4 Accumulation of polymorphonuclear leukocyte(PMN)in hepatic tissue in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

表4肝組織內中性粒細胞聚集程度(±s)Tab 4 Accumulation of polymorphonuclear leukocyte(PMN)in hepatic tissue in obstructive jaundice group and sham operation group at different time points after operation(±s)

與假手術組相比，＊＊P ＜0.01

組別 n PMN聚集程度(個/50HP)SM組30 32.40 ±4.69 OJ1 組 6 87.33 ±11.27＊＊OJ3 組 6 207.50 ±25.74＊＊OJ7 組 6 246.33 ±11.13＊＊OJ14 組 6 251.67 ±23.17＊＊OJ21 組 6 247.33 ±20.96＊＊

膽總管結扎組術后1 d血清HA及轉氨酶增高迅速，肝臟出現充血，水腫，有片狀壞死等急性改變;而假手術組早期血清HA明顯升高(1 d)，其后快速下降并穩定在較低水平?？梢?，HA早期快速升高一次性膽管完全梗阻所造成的急性肝臟損傷以及手術創傷有關。膽總管完全結扎后3 d開始，血清透明質酸逐步增高，反映膽道完全梗阻后早期即可影響肝竇內皮細胞功能變化［12］。長時間的膽道梗阻(21 d)，大鼠血清透明質酸明顯增高，并與梗阻性黃疸后肝臟纖維化程度相紊合。研究表明肝竇內皮細胞在肝臟纖維化過程中亦起一定的作用，表現為肝竇內皮細胞毛細血管化，并大量合成HA，因此臨床中可檢測血清 HA，用于肝纖維化的早期診斷［13］。本研究顯示梗阻性黃疸發生過程中，HA的變化趨勢與Cr的變化之間不具有相關性，其變化主要反映肝臟竇內皮細胞損傷的狀況。

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)存在于中性粒細胞的嗜天青顆粒中，約占細胞干重的5%，通過測定組織內MPO含量可用于推斷組織中中性粒細胞的聚集程度。本實驗通過測定肝臟組織中髓過氧化物酶的含量，以及結合形態學上觀察肝臟組織中中性粒細胞的聚集程度，顯示膽總管結扎組血清透明質酸的變化分別與肝臟組織內髓過氧化物酶含量、中性粒細胞聚集程度呈正相關性，表現為隨著梗阻時間的延長，肝臟組織內中性粒細胞聚集程度增加，表明肝竇內皮細胞的損傷與膽道梗阻導致的活化的中性粒細胞聚集有關。

梗阻性黃疸過程中因內毒素血癥的出現［14］，會使枯否細胞激活并產生一些前炎癥因子，如TNF-α、IL-6等，這些前炎癥因子將刺激中性粒細胞趨化因子和激活調節因子(IL-8、及細胞因子誘導的中性粒細胞趨化因子(cytokine-induced neutrophil chemoattractant，CINC)的釋放［15］。加之，肝內膽管擴張，竇壁細胞腫脹，血管收縮和舒張物質失平衡以及PMN變形能力低下等原因均有利于中性粒細胞在肝臟中聚集，該細胞在細胞因子、黏附分子等調控下，細胞在肝竇內滾動、黏附、滲出，并釋放炎癥因子、水解蛋白以及氧自由基等物質，導致肝竇內皮細胞損傷，進而加重肝臟損傷程度［16］。

綜上，本研究認為梗阻性黃疸后血清HA的早期明顯增高，可反映了肝臟內皮細胞功能的早期改變，而中性粒細胞在肝臟內大量聚集是導致梗阻性黃疸肝竇內皮細胞損傷，并致微循環障礙的主要原因。

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