免疫細胞化學染色和RT-PCR技術在胸腹腔積液檢測中的應用

張麗芳 黃海建 陳建偉 王旭洲 宋嶼娜 李華良

我們利用胸、腹腔積液制作成細胞塊，并進行免疫細胞化學染色和實時熒光定量PCR(Real-time PCR，RT-PCR)檢測，效果良好，介紹如下。

1 資料和方法

1.1 病例來源

收集2010年～2011年在南京軍區福州總醫院臨床送檢的胸、腹腔積液細胞學腫瘤陽性病例11例，其中肺腺癌7例，肺大細胞癌1例，卵巢癌3例。所有病例均制作細胞塊，行HE、免疫化學 CEA、Vimentin、TTF-1、CK5/6、Ki-67、CKH、CKL、Calretinin、CD56、Syn、CgA染色，8例肺癌病例行RT-PCR檢測。

1.2 試劑與儀器

EGFR外顯子19和21試劑盒購于北京金菩嘉公司，采用Taqman探針技術檢測EGFR基因外顯子19 de1-E746-A750、del-L747-P753insS突變，以及外顯子21 L858R、L861Q的突變;石蠟標本組織DNA提取試劑盒DEXPAT、Taq酶購于寶生物大連公司;RT-PCR儀為美國 ABI7500，基因擴增 PCR儀為美國ABI9700;所有引物均由北京賽百盛公司提供。

1.3 細胞塊制作方法

將臨床送檢的胸、腹腔積液標本在室溫下靜置10～20 min，用離心試管取容器底層標本10～20 ml，2 000 r/min離心8～10 min，棄上清保留沉淀物［1］。在試管內加入濃度為40 g/l的中性甲醛(10%中性福爾馬林)5～10 ml，與沉淀物混勻，室溫固定處理1 h，離心后棄上清，加入中性甲醛5～10 ml，混勻補充固定1 h后離心，棄上清，用濾紙包好沉淀物。若胸、腹腔積液中沉淀物少時，可再加入75%乙醇5～10 ml靜置30 min，使沉淀物凝固硬化，便于多收獲細胞和取材打包。經常規脫水和石蠟包埋，作4 μm厚切片，每個病例連續切片3張，分別行HE、免疫組化染色及PCR檢測。

1.4 免疫細胞化學染色方法

①石蠟切片4 μm，貼附在預先涂有0.01%多聚賴氨酸的玻片上，60～62℃烤片3 h;② 二甲苯脫蠟5 min×3次，100%、95%、80%和60%酒精各5 min，自來水流洗5 min;③0.01 mol/L pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中高壓修復1～2 min，冷卻至室溫，水洗2 min，PBS(pH7.4)洗2 min×3次;④ 切片入3%H2O2水溶液10 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS洗2 min×3次;⑤ 滴加工作濃度的第一抗體于37℃濕盒內孵育1～2 h，PBS洗2 min×3次;⑥ 滴加聚合物增強劑(試劑A)，室溫孵育20 min，PBS洗2 min×3次;⑦滴加酶標抗鼠/兔聚合物(試劑B)，室溫孵育30 min，PBS洗2 min×3次;⑧ AEC或DAB顯色，水洗2 min;⑨蘇木精復染1～2 min，中性樹膠封片。所用一抗及二抗 EliVisionTM plus試劑盒等均購自福建邁新公司。

1.5 RT-PCR 檢測

石蠟組織DNA提取采用TakaRa DEXPAT試劑盒。將3～5片10 μm厚的石蠟切片放于Eppendorf管中，加入DNA提取液10滴，充分混勻，100℃加熱10 min，13 000 r/mim 離心10 min，吸取其上清直接用于RT-PCR反應。DNA經紫外分光光度計定量，0.8%瓊脂糖電泳判定其質量。肺癌患者組織中EGFR 19、21外顯子RT-PCR檢測操作方法嚴格按照操作說明書進行。

2 結果

2.1 HE 染色

肺腺癌的染色片中:腫瘤細胞排列呈腺樣、花環樣結構，細胞中等大小，胞質淡染，可見胞質內分泌物，細胞異型性明顯，核分裂像不易見。肺大細胞癌的染色片中:腫瘤細胞呈巢狀分布，細胞體積大，胞質豐富略嗜伊紅，可見胞質內分泌物，部分可見1個核仁，細胞異型性明顯。卵巢腺癌的染色片中:腫瘤細胞排列呈腺樣、乳頭狀及巢狀等結構，細胞中等大小，胞質嗜堿，可見胞質內分泌物，細胞異型性明顯。

2.2 免疫細胞化學染色及RT-PCR檢測

7例肺腺癌病例，腫瘤細胞均呈CEA、TTF-1、CKL強陽性表達，Ki-67增殖指數30% ～50%之間，免疫細胞化學染色陰性抗體有 CK5/6、CKH、Vimentin、Calretinin、CD56、Syn、CgA。肺大細胞癌腫瘤細胞呈 CEA、CKL強陽性表達，CKH、CD56、Syn、CgA灶性陽性，Ki-67增殖指數50%，免疫細胞化學染色陰性抗體有CK5/6、Vimentin、Calretinin。3例卵巢腺癌的染色片中:腫瘤細胞呈CKL、CEA強陽性表達，Ki-67增殖指數45%，免疫細胞化學染色陰性抗體有 TTF-1、CK5/6、CKH、Vimentin、Calretinin、CD56、Syn、CgA(表 1)。

2.3 RT-PCR 結果

11例胸、腹腔積液細胞塊的EGFR的RT-PCR檢測顯示，第2例細胞塊標本檢出EGFR基因外顯子19 delE746-A750位點發生突變，其余病例均陰性。

表1 11例胸腹腔積液細胞塊免疫細胞化學染色及RT-PCR檢測結果

3 討論

臨床送檢的胸腹腔積液中，部分為腫瘤性胸腹腔積液，若充分利用并將其制作細胞塊進行石蠟切片，行HE染色、免疫組化和基因檢測等則可取得理想效果，為診斷和治療提供依據［2］。但腫瘤性胸腹腔積液中因含有大量紅細胞及多種蛋白質，在制作細胞塊過程中，40 g/l中性甲醛能及時固定有核細胞，所以收獲腫瘤細胞更多;同時經甲醛溶液多次洗滌可去除其中的紅細胞和內源性蛋白質，防止免疫細胞化學非特異性染色。

細胞塊石蠟包埋HE染色切片中，細胞呈單層平鋪狀排列，結構清晰易于辨認;其次背景清晰，有診斷價值的信息更多，另外細胞塊能連續切片，用于免疫細胞化學和基因突變檢測;蠟塊可存檔，有利于回顧性研究。

免疫細胞化學技術是在細胞學的基礎之上進行的，具有以下優點:細胞塊石蠟包埋切片能最大限度暴露和修復細胞內抗原，有利于抗原抗體結合，增加免疫細胞化學染色的敏感性;有診斷價值的細胞集中，行免疫細胞化學時可節約試劑量;組織塊可連續切片做多項染色，進行診斷或研究;細胞著色充分均勻，防止假陽性結果。

RT-PCR檢測可以定性和定量。利用RT-PCR檢測非小細胞肺癌患者的EGFR基因突變情況，可指導臨床靶向治療［3］。RT-PCR具有以下優點:RT-PCR技術可以實現標準化操作，支持靶向治療;特異性好，準確性高，靈敏度高;操作簡單、安全、自動化程度高和防污染。

［1］中華醫學會編著.臨床技術操作規范(病理學分冊)〔M〕.第1版.北京:人民軍醫出版社，2004:42.

［2］尹艷華，李玉紅，張 杰.胸腔積液細胞學及免疫細胞化學在鑒別肺轉移性腺癌和問皮細胞中的臨床價值分析〔J〕.現代腫瘤醫學，2007，9(15):1253.

［3］李永文，劉紅雨，李穎王，等.實時熒光定量PCR和測序法檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變的比較〔J〕.中國肺癌雜志，2009，12(12):1255.