復(fù)合溶劑選擇性純化紫杉醇的工藝研究

甘勇軍，廖家榮，嚴(yán)明志，張倩，高宏偉，胡湘南

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶市400016；2.四川遂寧市中醫(yī)院藥劑科，遂寧市 629000；3.重慶美聯(lián)制藥有限公司，重慶市 401122）

復(fù)合溶劑選擇性純化紫杉醇的工藝研究

甘勇軍1＊，廖家榮2，嚴(yán)明志2，張倩2，高宏偉3，胡湘南1#

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶市400016；2.四川遂寧市中醫(yī)院藥劑科，遂寧市 629000；3.重慶美聯(lián)制藥有限公司，重慶市 401122）

目的：研究復(fù)合溶劑選擇性純化紫杉醇的方法和工藝條件。方法：采用不同種類的溶劑在不同條件下對(duì)紫杉醇進(jìn)行精制，以高效液相色譜法測(cè)定的紫杉醇粗品含量和主要雜質(zhì)峰峰面積為指標(biāo)，考察最佳的溶劑種類和工藝參數(shù)。結(jié)果：最佳工藝為純化強(qiáng)極性雜質(zhì)較高的紫杉醇，采用紫杉醇-丙酮-乙酸乙酯-正己烷（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）于－25℃冷凍24 h；純化弱極性雜質(zhì)較高的紫杉醇，采用紫杉醇-丙酮-三氯甲烷-正己烷（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）于－25℃冷凍24 h。結(jié)論：采用丙酮、正己烷分別與乙酸乙酯或三氯甲烷純化紫杉醇，對(duì)于不同極性的雜質(zhì)具有良好選擇性，可用于紫杉醇的選擇性純化。

紫杉醇；復(fù)合溶劑；純化

紫杉醇是從天然植物紅豆杉屬樹皮中提取的一種抗癌新藥，由于其結(jié)構(gòu)新穎，作用機(jī)制獨(dú)特，故紫杉醇的開發(fā)利用被譽(yù)為20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥三大成就之一[1]。紫杉醇是目前世界上最有效的新型抗微管藥物，它的作用機(jī)制有別于其他抗微管藥物[2]，其主要是通過(guò)刺激微管的聚合，促進(jìn)微管雙聚體裝配成微管，使微管超穩(wěn)定，最終使細(xì)胞增殖停止在有絲分裂期的G2/M期[3]。

文獻(xiàn)報(bào)道，紫杉醇可采用一種或者兩種溶劑純化，比如采用甲醇純化、甲醇與水純化、丙酮與正己烷純化等方法[4，5]。其中，甲醇純化、甲醇與水純化，對(duì)部分雜質(zhì)無(wú)效，收率不高；丙酮與正己烷純化收率高，對(duì)大部分雜質(zhì)敏感，但是對(duì)于不同極性雜質(zhì)選擇性不好。本試驗(yàn)嘗試在丙酮與正己烷溶劑體系中加入1種溶劑組成3種溶劑體系，以期達(dá)到高收率且選擇性純化紫杉醇。

1 儀器與試藥

Aglent 1200型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；Heiolph 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)海道爾夫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀廠）；GB1302電子天平（瑞士Mettler-Toledo有限公司）；ZF-20C暗箱式三用紫外分析儀（上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司）。

紫杉醇原料（重慶美聯(lián)制藥有限公司，含量：72.8%）；紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（成都杰銳科技有限公司進(jìn)口，含量≥98%，批號(hào)：SOC180）；甲醇為色譜純，水為純化水，甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等試劑均為分析純。

2 方法

2.1 紫杉醇粗品的制備

取紫杉醇原料5份，各5.0 g，按表1中的溶劑種類與體積進(jìn)行純化，大量析出晶體后于－25℃冷凍12 h，抽濾，濾餅用二氯甲烷溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸干，得到紫杉醇粗品。

表1 精制紫杉醇的溶劑種類與體積Tab 1 Types and volume of solvent used for refining paclitaxel

2.2 紫杉醇的鑒別

2.2.1 色譜條件色譜柱：Symmetry Shield RPC18（150 mm×3.9 mm，4 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（62∶38）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：227 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 供試品和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取“2.1”項(xiàng)下紫杉醇粗品和紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，加甲醇分別配制成濃度為0.4 mg·mL-1的供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.3 紫杉醇的鑒定方法 按上述色譜條件對(duì)紫杉醇粗品進(jìn)行含量測(cè)定，HPLC圖中，紫杉醇粗品溶液的主峰保留時(shí)間應(yīng)與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的主峰保留時(shí)間一致。

2.2.4 紫杉醇含量和雜質(zhì)測(cè)定 按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品中紫杉醇的含量；采用面積歸一化法，計(jì)算保留時(shí)間在30 min前的雜質(zhì)峰面積占總面積的百分比（簡(jiǎn)稱純度），選取紫杉醇粗品中7個(gè)主要雜質(zhì)，比較純化前、后雜質(zhì)變化情況。在此條件下先出峰的雜質(zhì)極性相對(duì)較強(qiáng)，后出峰的雜質(zhì)極性相對(duì)較弱。

2.2.5 紫杉醇收率的測(cè)定方法 按“2.2.4”項(xiàng)下含量測(cè)定方法分別測(cè)定純化前粗品含量和純化后樣品的含量，分別計(jì)算純化前和純化后的純品量，純化后的純品量與純化前紫杉醇純品量的比值，即為紫杉醇收率。

3 結(jié)果

3.1 紫杉醇鑒定

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，供試品溶液的主峰保留時(shí)間與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的主峰保留時(shí)間一致，表明供試品溶液中含有紫杉醇成分；保留時(shí)間30 min內(nèi)，供試品溶液色譜中出現(xiàn)了7個(gè)主要的雜質(zhì)峰，從左到右依次為雜質(zhì)A、B、C、D、E、F、G。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品；B.供試品Fig 1 HPLC chromatograms A.paclitaxel control；B.test samples

3.2 紫杉醇含量和收率的測(cè)定

按“2.2.4”、“2.2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定紫杉醇粗品含量和收率。結(jié)果，試驗(yàn)3、4、5（丙酮、正己烷體系）所得粗品含量、收率優(yōu)于試驗(yàn)1、2（甲醇體系）。紫杉醇粗品的含量和收率見圖2。

圖2 紫杉醇粗品的含量和收率Fig 2 The content and yield of paclitaxel crude products

3.3 紫杉醇雜質(zhì)的測(cè)定

選取紫杉醇粗品中7個(gè)主要雜質(zhì)，以純度為指標(biāo)，比較純化前、后雜質(zhì)降低情況。結(jié)果，試驗(yàn)1、2（甲醇體系）對(duì)部分雜質(zhì)的純化基本無(wú)效；試驗(yàn)3、4、5（丙酮、正己烷體系）對(duì)所有雜質(zhì)的純化均有效，并且雜質(zhì)去除效果優(yōu)于試驗(yàn)1、2（甲醇體系）；與試驗(yàn)3比較，試驗(yàn)4對(duì)極性較強(qiáng)的雜質(zhì)更有效，試驗(yàn)5對(duì)極性較弱的雜質(zhì)更有效。紫杉醇粗品純化后雜質(zhì)降低情況見圖3。

圖3 紫杉醇粗品精制后雜質(zhì)降低情況Fig 3 The profiles of impurities reduction after refining taxol crude products

3.4 工藝優(yōu)化

由“3.2”、“3.3”試驗(yàn)結(jié)果可知，試驗(yàn)3、4、5選擇的純化體系更好，故對(duì)這幾個(gè)體系進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳的純化工藝。

3.4.1 結(jié)晶溶劑比例優(yōu)化 取紫杉醇原料4份，各5.0 g，按表2的溶劑種類與比例，照“2.1”項(xiàng)下方法制備紫杉醇粗品。并按“2.2.4”、“2.2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定紫杉醇粗品含量和收率以及雜質(zhì)變化情況（記為試驗(yàn)6、7、8、9）。結(jié)果，試驗(yàn)6、7、8、9所得粗品含量與試驗(yàn)4、5相近；試驗(yàn)6、7收率較高，試驗(yàn)8、9收率稍低；試驗(yàn)6、7相對(duì)于試驗(yàn)4，對(duì)極性較強(qiáng)的雜質(zhì)更有效，試驗(yàn)7效果最好，即隨著乙酸乙酯體積增加對(duì)極性較強(qiáng)的雜質(zhì)更有效；試驗(yàn)8、9相對(duì)于試驗(yàn)5，對(duì)極性較弱的雜質(zhì)更有效，試驗(yàn)9效果最好，即三氯甲烷體積增加對(duì)極性較弱的雜質(zhì)更有效。綜合以上情況，選擇試驗(yàn)7、9進(jìn)行純化時(shí)間和溫度的優(yōu)化。紫杉醇粗品的含量和收率見圖4；紫杉醇粗品純化后雜質(zhì)降低情況見圖5。3.4.2 純化溫度的優(yōu)化 重復(fù)表2中試驗(yàn)7、9，分別于5、－10、－25℃冷凍12 h后，抽濾，濾餅用二氯甲烷溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸干，得到紫杉醇粗品，并按“2.2.4”、“2.2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定紫杉醇粗品含量和收率以及雜質(zhì)變化情況。結(jié)果，溫度變化后，試驗(yàn)7、9得到的粗品含量變化不大，低溫條件下收率較高，在－25℃下收率最高；低溫條件下某些雜質(zhì)有所增多，但變化不明顯。綜合收率以及雜質(zhì)情況，選擇最佳的純化溫度為－25℃。紫杉醇粗品的含量和收率見圖6；紫杉醇粗品純化后雜質(zhì)降低情況見圖7。

表2 精制紫杉醇的溶劑種類與比例Tab 2 Types and volume of solvent used for refining paclitaxel

圖4 紫杉醇粗品的含量和收率Fig 4 The content and yield of paclitaxel crude products

圖5 紫杉醇粗品精制后雜質(zhì)降低情況Fig 5 The profiles of impurities reduction after refining paclitaxel crude products

圖6 紫杉醇粗品的含量和收率Fig 6 The content and yield of paclitaxel crude products

圖7 紫杉醇粗品精制后雜質(zhì)降低情況Fig 7 The profiles of impurities reduction after refining paclitaxel crude products

3.4.3 時(shí)間的優(yōu)化 重復(fù)表2中試驗(yàn)7、9，分別于－25℃冷凍8、12、24 h后，抽濾，濾餅用二氯甲烷溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸干，得到紫杉醇粗品，并按“2.2.4”、“2.2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定紫杉醇粗品含量和收率以及雜質(zhì)變化情況。結(jié)果，冷凍時(shí)間變化后，試驗(yàn)7、9得到的粗品含量變化不大，長(zhǎng)時(shí)間冷凍條件下收率較高，冷凍24 h收率最高；隨著純化時(shí)間的增加，雜質(zhì)有所增加，因此選擇最佳純化時(shí)間為24 h。紫杉醇的含量和收率見圖8；紫杉醇粗品純化后雜質(zhì)降低情況見圖9。

4 討論

在《美國(guó)藥典》中，紫衫醇含量和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定是用甲醇、乙腈和水3項(xiàng)體系，梯度洗脫。筆者試驗(yàn)中采用過(guò)的色譜柱，以甲醇和水體系即能將所有的雜質(zhì)分開；同時(shí)，測(cè)定紫杉醇的含量與雜質(zhì)的方法與《美國(guó)藥典》采用的方法基本相同，說(shuō)明本方法適用于本品的含量和雜質(zhì)測(cè)定。在此體系中，紫杉醇出峰時(shí)間在8.5 min左右，幾乎所有的雜質(zhì)均在30 min（紫杉醇主峰保留時(shí)間的3.5倍）內(nèi)出峰，故文中討論的均是30 min以前的色譜峰，且筆者采集5倍主峰保留時(shí)間，以便所有的雜質(zhì)都能檢測(cè)到。

圖8 紫杉醇粗品的含量和收率Fig 8 The content and yield of paclitaxel crude products

圖9 紫杉醇粗品精制后雜質(zhì)降低情況Fig 9 The profiles of impurities reduction after refining paclitaxel crude products

按照反相色譜柱的一般規(guī)律，紫杉醇峰前的雜質(zhì)一般認(rèn)為比紫杉醇的極性大，紫杉醇峰后的雜質(zhì)比紫杉醇極性小。因此，文中將紫杉醇雜質(zhì)劃分為極性強(qiáng)的雜質(zhì)和極性弱的雜質(zhì)。

復(fù)合溶劑純化紫杉醇最佳工藝條件為對(duì)于強(qiáng)極性雜質(zhì)較高的紫杉醇純化，采用紫杉醇-丙酮-乙酸乙酯-正己烷（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）系統(tǒng)，于－25℃冷凍24 h；對(duì)于弱極性雜質(zhì)較高的紫杉醇純化，采用紫杉醇-丙酮-三氯甲烷-正己烷（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）系統(tǒng)，于－25℃冷凍24 h。此工藝析晶速度較快，溶劑易揮發(fā)，操作時(shí)應(yīng)注意控制溫度、攪拌速度、溶劑體積以及滴加速度。含量為72.8%的紫杉醇原料經(jīng)丙酮-三氯甲烷-正己烷、丙酮-乙酸乙酯-正己烷、丙酮-正己烷純化，得到紫杉醇成品，含量為99.6%，純度為99.8%，最大單個(gè)雜質(zhì)0.05%，熔點(diǎn)219～221℃。

[1] 張恩娟，張 昭，陳湘潘.紫杉醇的藥代動(dòng)力學(xué)研究概況[J].中國(guó)藥房，1999，10（4）：187.

[2] 程玉龍，莊永志.紫杉醇聯(lián)合卡鉑治療Ⅲb期和Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌的臨床觀察[J].中國(guó)藥房，2003，14（10）：612.

[3] 唐躍年，陳 穎，孫朝榮，等.紫杉醇靜脈輸注的注意事項(xiàng)[J].中國(guó)藥房，2006，17（12）：946.

[4] 閻家麒.紫杉醇提取純化工藝[J].中國(guó)醫(yī)藥雜志，1996，27（12）：531.

[5] 李春斌.東北紅豆杉紫杉醇的提取純化與HPLC檢測(cè)[J].大連民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，7（5）：22.

Selective Purification Study of Paclitaxel with Complex Solvents

GAN Yong-jun，HU Xiang-nan（Institute of Life Sciences，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）
LIAO Jia-rong，YAN Ming-zhi，ZHANG Qian（Dept.of Pharmacy，Suining Municipal Hospital of TCM，Suining 629000，China）
GAO Hong-wei（Chongqing United Pharmaceuticals Co.，Ltd.，Chongqing 401122，China）

OBJECTIVE：To study the selective purification study of paclitaxel with complex solvents.METHODS：The paclitaxel was refined using different types of solvents under different conditions.The best solvent types and process parameters were obtained from HPLC detection of paclitaxel content and the main impurity peak area as index.RESULTS：The optimal technology was to purify strongly polar paclitaxel with high impurity，paclitaxel-acetone-ethyl acetate-n-hexane（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）were frozen at－25 ℃for 24 h；to purify weak polar paclitaxel with high impurity，paclitaxel-acetone-chloroform-n-hexane（1 g∶8 mL∶6 mL∶7 mL）were frozen at－25 ℃ for 24 h.CONCLUSION：The uses of acetone or n-hexane and ethyl acetate or chloroform were refined for different polar impurities with good selectivity，and it can be used for the selective purification of paclitaxel.

Paclitaxel；Complex solvents；Purify

R284.2；R943

A

1001-0408（2011）23-2145-03

＊助理研究員，碩士。研究方向：藥物化學(xué)。電話：023-68485161。E-mail：cqjy0708@126.com

#通訊作者：副教授，碩士研究生導(dǎo)師。研究方向：藥物化學(xué)。電話：023-66729212。E-mail：huxiangnan62@126.com

2011-03-10

2011-04-10）