BMSCs移植對大鼠腦梗死后神經功能恢復及Nogo－A 表達的影響

郝 光 楊鳳剛 馮念蘋 金永華 梁松嵐

腦梗死具有發病率、致殘率和致死率均較高的特點，目前臨床藥物的治療作用有限，人類一直在探索嘗試其它的治療方法。近年來，BMSCs移植治療腦梗死成為相關研究人員努力的熱點方向，動物實驗顯示移植治療可改善神經功能缺損癥狀，亦有不少應用于臨床的報道，但是BMSCs移植治療腦梗死的確切機制仍然有待于完善。Nogo－A 是目前公認的神經軸突生長抑制因子，既往研究表明抑制Nogo－A 蛋白作用可促進神經再生［1］。因此，本研究從BMSCs移植治療與腦梗死后神經再生的關系入手，觀察移植后腦組織Nogo－A 表達水平的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 培養液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Hyclone 公司）；TRIzol試劑（invitrogen公司）；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0［寶生物工程（大連）有限公司］；Nogo－A 兔抗多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；二氨基聯苯胺（DAB）顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物及分組

細胞培養：健康SD 大鼠，體質量80～120 g，動物模型：健康雄性SD 大鼠，體質量220～280 g，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。將實驗動物分為假手術組（sham 組）、模型對照組（MCAO 組）、溶劑對照組（Vehicle組）和移植組（BMSCs組），各組再按時間點分為3、7、14、21 d組，移植組3 d組12只，6只用于取材，6只用于觀察BMSCs分布，其余各組6只。

1.3 局灶性腦缺血再灌注模型建立

采用改良Longa法［2］制備大鼠左側大腦中動脈閉塞再灌注模型。用10%水合氯醛（0.35 ml／100 g）腹腔麻醉大鼠，在頸部正中略偏左行2.0～2.5 cm 縱向切口，暴露并小心分離出左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，線栓自頸總動脈剪口處插入頸內動脈，自頸動脈分叉處計算插線長度約18～20 mm。假手術組除不插入線栓外，其余過程同上。腦缺血2 h后輕輕抽出尼龍線至有阻力感，實施再灌注。按Zea－longa評分標準［2］對術后大鼠評分，0分：無神經缺損癥狀；1 分：不能伸展右側前爪；2分：行走時向右側轉圈；3分：行走時向右側傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失，1～3分者納入實驗。

1.4 神經功能缺損程度評分

評分觀察者為非本試驗組人員，在損傷后不同時間點參照Chen等［3］發表的改良神經功能缺損程度 評 分（modified neurological severity score，mNSS）方法，去掉了一些不易判斷結果的項目，如深感覺檢測、平衡試驗等。所有大鼠在術后3、7、14、21 d分別進行評分。

1.5 BMSCs的分離與培養

脫頸處死大鼠，無菌操作取出雙側股骨、脛骨，暴露骨髓腔。用注射器抽取DMEM 培養液（含10%胎牛血清）沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞液，用200目無菌金屬濾網過濾；以1×109個／L 的密度接種于培養瓶中，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養；接種后48 h更換培養液，去除未貼壁細胞，此后每2 d更換培養液1次；培養10～14 d，以1∶2的比例傳代培養；其后每2d更換培養液1次，每7～10 d傳代1次。

1.6 BMSCs的標記與移植

收集第三代BMSCs，綠色熒光染料羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）標記。BMSCs組經大鼠尾靜脈注入3×109個／L BMSCs懸液1 mL，Vehicle組注入0.01 mol／L PBS 1 mL。

1.7 RT－PCR法測定Nogo－A 基因的表達水平

分別取各組大鼠腦損傷周邊區組織（液氮凍存）20 mg，Trizol法提取總mRNA，以逆轉錄法翻譯成cDNA，再進行PCR 擴增。

1.8 BMSCs在腦內分布的觀察

移植3d組處死6只大鼠，迅速取出腦組織，立即放入液氮中，以視交叉為中心定位制成冰凍切片，丙酮固定5 min，倒置熒光顯微鏡下，用波長488 nm的激發光觀察由CFSE 標記的BMSCs在移植大鼠腦內的存活及分布情況。

1.9 免疫組織化學染色

各組大鼠按相應時間點過量麻醉，左心室插管，先后灌注0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛溶液各100 mL內固定，然后斷頭取腦，置于超過標本體積10倍的4%多聚甲醛溶液中外固定至24 h，以視交叉為中心向前、后各取2 mm 厚的冠狀位腦片，充分固定后常規脫水、透明、石蠟包埋、連續切片進行免疫組織化學染色，檢測Nogo－A 蛋白的表達水平。Nogo－A 抗體滴度為1∶30。光學顯微鏡下觀察，胞漿中有棕黃色顆粒的為陽性細胞。每張切片于梗死灶周圍選擇10個表達最強的視野，計數陽性細胞數后取平均值。

1.10 統計學處理

數據用均數±標準差表示，采用SAS 9.0軟件，mNSS評分采用非參數檢驗比較，其余數據采用方差分析。P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結 果

2.1 BMSCs的分離與培養

原代培養的骨髓細胞接種第3 d，部分貼壁生長，多呈長梭形、三角形和多角形，即為BMSCs；第5 d開始，部分BMSCs形成集落；于第7～12 d開始呈指數增長，具有一定的方向性，呈束狀或放射狀排列；第14 d左右分布較散亂，單細胞數量多，細胞貼壁率達90% （圖1）。傳代培養的BMSCs形態多為長梭形，較原代細胞體積增大，增殖速度加快，貼壁能力增強，約7 d左右貼壁率達80%～90%（圖1）。

2.2 BMSCs在腦組織中的分布

熒光顯微鏡下可觀察到發綠色熒光的BMSCs，并與周圍組織很好整合（圖2）。

圖1 光學顯微鏡下原代培養14 d（A）及第三代（B）BMSCs（×100倍）

圖2 熒光顯微鏡下移植BMSCs分布（CFSE×200倍）

2.3 大鼠行為學評分

BMSCs組在第7、14 和21 d mNSS 評分均低于MCAO 組和Vehicle組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組不同時間點mNSS評分（±s，n＝6）

表1 各組不同時間點mNSS評分（±s，n＝6）

注：與MCAO 組比較，＃P＜0.05；與Vehicle組比較，＊P＜0.05

組別 mNSS 評分第3 d 第7 d 第14 d 第21d 63 Vehicle組3.50±0.55 2.83±0.75 2.33±0.52 2.00±0.63 BMSCs組3.33±0.52 1.83±0.41＃＊1.17±0.41＃＊1.17±0.41＃＊MCAO 組 3.67±0.52 2.83±0.75 2.17±0.75 2.00±0.

2.4 RT－PCR 法檢測Nogo－A mRNA 的表達水平

Sham 組Nogo－A mRNA在各個時間點均呈較低水平表達，MCAO 組和Vehicle組于造模成功后第3 d Nogo－A mRNA表達水平增加，第7 d下降，第14 d達到高峰，第21 d有所下降，但仍然高于第3 d水平。MCAO 組 和Vehicle組 在 第3、14 和21 d Nogo－A mRNA的表達水平均高于Sham 組（P＜0.05）。BMSCs組Nogo－A mRNA的表達水平在第3、14和21 d均低于MCAO 組和Vehicle組（P＜0.05）。其中，BMSCs組在第14 d Nogo－A mRNA 的表達水平仍高于Sham 組（P＜0.05）（圖3，表2）。

圖3 各組Nogo－AmRNA 及β－actin RT－PCR凝膠電泳圖像（A 為第3 d；B為第7 d：C為第14 d；D 為第21 d）

表2 各組不同時間點Nogo－A mRNA 相對表達量（±s，n＝6）

表2 各組不同時間點Nogo－A mRNA 相對表達量（±s，n＝6）

注：與Sham 組比較，＃P＜0.05；與MCAO 組比較，＊P＜0.05；與Vehicle組比較，△P＜0.05

組別 Nogo－A mRNA 相對表達量第3 d 第7 d 第14 d 第21d Sham 組 0.52±0.08 0.53±0.04 0.53±0.07 0.51±0.06 MCAO 組 0.65±0.07＃ 0.54±0.06 0.99±0.10＃ 0.76±0.09＃Vehicle組 0.64±0.08＃ 0.55±0.05 0.97±0.07＃ 0.76±0.10＃BMSCs組 0.53±0.06＊△0.49±0.04 0.72±0.07＃＊△0.60±0.07＊△

2.5 免疫組化法檢測Nogo－A 的表達水平

Nogo－A 陽性染色主要在少突膠質細胞中表達，神經元中也有表達，大體成環狀或半弧形分布。Sham 組各時間點損傷區周邊白質中可見少量散在的Nogo－A 陽性細胞，MCAO 組和Vehicle組Nogo－A 陽性染色細胞數于造模成功后第3 d增加，第7 d有所減少，第14 d達到高峰，第21 d又減少，在第3、14和21 d時Nogo－A 陽性染色細胞數均高于Sham 組相應時間點（P＜0.05）。BMSCs組Nogo－A 陽性細胞數在第3、14和21 d均少于MCAO 組和Vehicle組（P＜0.05），其中，BMSCs 組第14 d Nogo－A 陽性染色細胞數仍高于Sham 組第14 d時的表達水平（P＜0.05）（表3，圖4）。

表3 各組不同時間點Nogo－A 陽性細胞數比較（±s，n＝6）

表3 各組不同時間點Nogo－A 陽性細胞數比較（±s，n＝6）

注：與Sham 組比較，＃P＜0.05；與MCAO 組比較，＊P＜0.05；與Vehicle組比較△P＜0.05

組別 Nogo－A 陽性細胞數（個／每400視野）第3 d 第7 d 第14 d 第21d Sham 組 20.87±4.11 22.82±5.79 22.65±5.79 23.77±7.58 MCAO 組 31.02±3.85＃ 25.07±3.00 52.28±4.55＃ 39.60±5.84＃Vehicle組 31.90±3.03＃ 26.10±3.74 54.87±6.04＃ 39.00±4.90＃BMSCs組 24.97±4.20＊△21.93±2.68 40.77±6.68＃＊△30.38±3.86＊△

圖4 光學顯微鏡下各組Nogo－A 表達水平（×400倍）（a為Sham 組；b為MCAO 組；c為Vehicle組；d為BMSCs組）

3 討 論

腦梗死給腦組織造成了嚴重的損傷。在梗死灶中心區神經元及膠質細胞等死亡，而中樞神經再生能力弱，特別是神經元，屬于永久性細胞，失有絲分裂能力，因此最終導致了永久的神經功能喪失。截至目前，公認的中樞神經再生困難的原因有兩個，一是由于中樞神經系統本身再生能力微弱；再者是抑制性微環境阻礙了神經再生。形成抑制微環境的因子有Nogo－A、髓磷脂相關糖蛋白（MAG）、少突膠質細胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）三種髓鞘源性蛋白，以及硫酸軟骨素蛋白多糖Ephrins、信號素、Slits、神經生長因子、骨形態發生蛋白質和Wnts等［4］。Nogo－A 是Nogo基因編碼的三種蛋白之一，是主要的髓鞘源性軸突再生抑制蛋白之一，主要由少突膠質細胞產生，在少突膠質細胞的胞漿和髓鞘中高表達，在一些神經元上也有表達，參與中樞神經系統損傷發生發展的全過程［5］。目前研究發現胞膜綁定的Nogo－A 分子有三個活性區域。首先，是Nogo－66域，是由66個氨基酸殘基組成的親水性袢環結構，位于Nogo－A 的C端，與受體NgR1結合，可抑制神經軸突的生長和誘導生長錐塌陷；其次是由Nogo－A 一個特殊外顯子編碼的區域，Oertle等研究證明此區域可以抑制軸突生長和3T3成纖維細胞伸展，并可誘導生長錐塌陷［6］；再者Nogo－A 的N 端存在一個稱為amino－Nogo的結構域，可通過直接或間接的阻斷結合素來阻斷軸突生長和細胞粘附［7］。

干細胞移植治療技術方興未艾。大量的動物實驗表明，BMSCs 移植可通過向神經細胞分化替代［8］、營養神經作用［9］、促進血管重建［10］等機制促進神經神功恢復。部分學者已大膽地進行了少量的臨床應用研究，結果顯示治療有效，并未見到明顯的不良反應［11，12］。但是BMSCs移植治療中樞神經系統損傷的機制仍然不夠全面和確切，典型損傷如腦梗死在不同時間不同移植途徑下的作用機制不夠清楚，特別是關于BMSCs移植和神經再生的關系研究不多。

本研究采用全骨髓貼壁法分離培養BMSCs，培養至第3代后用CFSE 標記，然后經尾靜脈移植到MCAO 模型大鼠體內。在腦缺血再灌注損傷后第3 d，在損傷周邊區腦組織中觀察到CFSE 染色的綠色陽性細胞，表明移植的BMSCs在第3 d已經能向受損部位遷移、募集、存活。mNSS評分結果顯示，BMSCs組在第7、第14 和第21 d較MCAO 組和Vehicle組得分下降，且差異具有顯著性，說明BMSCs移植能夠促進腦缺血再灌注損傷大鼠的神經功能恢復。通過RT－PCR 和免疫組織化學染色發現在MCAO 組和Vehicle組的多個時間點Nogo－A表達量較Sham 組增加；其趨勢為損傷后第3 d Nogo－A 的表達開始增加，第7 d下降至同Sham 組水平，第14 d達到高峰，第21 d又下降但仍高于第3 d水平，而BMSCs組損傷周邊白質中Nogo－A 水平在第3、14、和21 d較MCAO 組和Vehicle組降低，且差異具有顯著性，因此本研究推測出腦梗死后的一定時期內Nogo－A 的表達增加阻礙了神經功能的恢復，而BMSCs移植對Nogo－A 的表達水平有一定的抑制作用，在一定程度上解除了神經再生的瓶頸，使得神經功能得到較快的恢復。但本研究結果還顯示，MCAO 組 和Vehicle組 在 第7 d 時Nogo－A 表達水平下降回到假手術組水平，這與國內部分學者的實驗結果基本一致［13］。

綜上所述，BMSCs移植治療可促進大鼠腦梗死后的神經功能恢復，其作用機制可能與下調Nogo－A 的表達水平有關。但BMSCs移植后Nogo－A 表達下調的具體機制及兩者在腦梗死后更長時期內的作用過程仍有待于探討。

1 Chen MS，Huber AB，van der HaarME，et al.Nogo－A is a myelin－associated neurite outgr owth inhibit or and an antigen for monocl onal antibody I N21.Nature，2000，403（6768）：434－439.

2 Longa E Z，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible midle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20（1）：84－91.

3 Chen J，Li Y，Wang L，et al.Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats.J Neurol Sci，2001，189（1－2）：49－57.

4 Bolsover S，Fabes J，Anderson PN.Axonal guidance molecules and the failure of axonal regeneration in the adult mamm－alian spinal cord.Restorative Neurology and Neuroscience，2008，26（2－3）：117－130.

5 Prinjha R，Moore S E，Vinson M，et al.Inhibitor of neurite outgrowth in humans.Nature，2000，403（6768）：383－384.

6 Oertle T，van der Haar ME，Bandtlow CE，et al.Nogo－A inhibits neurite out－growth and cell spreading with three discrete regions.J Neurosci，2003，23（13）：5393–5406.

7 Hu F，Strittmatter SM.The N－terminal domain of Nogo－A inhibits cell adhesion and axonal outgrowth by an integrin－speci？c mechanism.The Journal of Neuro－science，2008，28（5）：1262–1269.

8 Choi CB，Cho YK，Prakash KV，et al.Analysis of neuron－like differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells.Biochem Biophys Res Commun，2006，350（1）：138－146.

9 Chen Q，Long Y，Yuan X，et al.Protective effects of bone marrow stromal cell transplantation in injured rodent brain：synthesis of neurotrophic factors.J Neurosci Res，2005，80（5）：611－619.

10 Hess DC，Hill WD，Martin SA，et al.Bone marrow as a source of endothelial cells and NeuN－expressing cells after stroke.Stroke，2002，33（5）：1362－1368.

11 Bang OY，Lee J S，Lee PH，et al.Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients.Aan Neurol，2005，57（6）：874－882.

12 孟憲國，朱士文，高 華，等.自體骨髓間充質干細胞移植治療腦梗死：6個月隨訪.中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（32）：6374－6378.

13 趙 紅，高曉玉，王得新，等.腦缺血再灌注模型大鼠神經生長抑制因子Nogo－A 的表達變化.中風與神經疾病雜志，2009，26（1）：4－7.