慢性束縛應激對大鼠體質量、血清皮質酮和前額葉皮質cAMP－PKA－CREB－BDNF通路的影響

孟珊珊 劉洪文

抑郁癥是一種常見的精神障礙，它以情感病態變化（主要是情緒低落）為顯著特征。抑郁癥的發生與多種因素有關，其中很重要的一個因素就是機體持續暴露于應激條件下。盡管一定程度的應激是有益的。但是機體長時間處于應激狀態下會導致抑郁癥的發生［1～3］。不同的應激模型被用來研究應激反應的不同方面。慢性束縛應激作為一種慢性應激模型，已被廣泛的應用到應激相關的精神疾病基礎研究中［4，5］。慢性束縛應激模型是將動物持續暴露于不可逃避的束縛應激。本研究采用這種模型，觀察應激后大鼠的體質量、血清皮質酮和前額葉皮質cAMP－PKA－CREB－BDNF通路的變化，為探索應激發生的分子病理機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Sprague－Dawley大鼠30只。體重180～200 g，購自哈爾濱醫科大學動物中心；大鼠購回后適應1周開始實驗，置于自然晝夜節律光照條件下，在標準潔凈的嚙齒動物籠內飼養，墊料為木屑，每4 d更換1次，自由進食、飲水，每籠2～3只，控制室溫（22±2）℃；大鼠隨機分為3組：對照組、慢性束縛應激1周組和慢性束縛應激2周組，每組各10只。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 （1）對照組不做任何應激處理，僅在應激組應激階段禁水禁食；（2）慢性束縛應激組分別進行1周和2周慢性束縛應激；慢性束縛應激是將應激組大鼠置于有機玻璃制成的束縛管中，管壁鑿有直徑0.4 cm 的小孔，確保通風良好；大鼠在束縛管中有限的空間活動，但不會造成肉眼可見的軀體上的傷害；大鼠每日應激6 h（9：00～15：00），連續進行1周和2周，每日應激階段禁水禁食，應激結束后將其放回正常飼養的籠具中，此時可以自由飲水進食。

1.2.2 體質量測量 所有大鼠均在應激前、應激1周和2周后用電子動物秤稱體質量1次。體質量增加量等于每周末體質量減去每周開始時體質量。

1.2.3 血清皮質酮濃度測定 最后一次實驗結束后第2 d上午10：00～11：00，麻醉后處死大鼠，斷頭取血，置于離心管內，室溫下4000 r／min 離心10 min，取上清液置－20℃冰箱保存，待測皮質酮水平；采用酶聯免疫吸附試驗（Enzyme－Linked Immunosorbent Assays，ELLISA）法測定皮質醇濃度，操作步驟按照皮質酮試劑盒說明書（DE3600，R＆D Systems，Inc）進行。

1.2.4 額葉皮質cAMP 含量、PKA 活性和BDNF表達水平測定

將皮質組織于4℃復溫，加入2 ml預冷50 mmol／L醋酸緩沖液（pH4.75），勻漿后靜置5 min，3500r／min離心15 min，收集上清液；60℃烘干后，4℃保存待測，采用放免法測定cAMP含量，ELISA法測定BDNF 表達水平（西唐生物公司）。另取皮層組織約50 mg，加入PKA 抽提緩沖液0.25 ml［25 mmol／L Tris－HCl（pH7.14），0.5 mmol／L EDTA，0.5 mmol／L EGTA，10 mmol／Lβ巰基乙醇，1μg／L亮肽素，1μg／L 抑肽酶］，冰浴上勻漿；將勻漿液傾入離心管中，4℃、3500 r／min離心5 min，吸取上清液，測定時按試劑盒（Promega公司）說明書步驟操作，酶活性單位為units／ml。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western－blotting） 各組大鼠在斷頭取血測血清皮質酮濃度的同時，取雙側前額葉皮質標本，冰上裂解、勻漿，取上清液；經蛋白定量后聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳、蛋白質的電轉移和膜封閉；封閉結束后分別用小鼠抗大鼠p－CREB抗體溶液、兔抗大鼠CREB 抗體溶液和小鼠抗大鼠β－actin抗體溶液室溫孵育，以上三種抗體均購自Sigma公司；二抗孵育后顯色、曝光、顯影及掃描免疫印跡條帶并進行分析。

1.2.6 統計學處理 采用SPSS12.0統計軟件，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，各組比較采用單因素方差分析（PostHoc LSD 法），各組自身前后比較采t檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠體質量的變化

第1周應激組大鼠體質量增長［（35±11）g與對照組（59±16）g］相比明顯降低（P＜0.05）；第2周應激組體質量增長［（23±8）g］明顯低于對照組［（68±14）g］（P＜0.05）（圖1）。

圖1 應激組與對照組大鼠體質量增長比較與第1周對照組比較，＊P＜0.05；與第2周對照組比較，＃P＜0.05

2.2 大鼠血清皮質酮水平的變化

對照組、束縛應激1周組和束縛應激2周組大鼠血清皮質醇濃度分別為（198.21±101.35）ng／ml、（356.78±112.21）ng／ml和（558.49±98.32）ng／ml，應激各組均高于對照組（表1）。

表1 大鼠血清皮質酮水平（ng／ml）

2.3 前額葉皮質cAMP－PKA－CREB－BDNF 通路的變化

慢性束縛應激1周和慢性束縛應激2周組大鼠前額葉皮質的cAMP 含量、PKA 活性和BDNF 表達水平顯著低于對照組，p－CREB 蛋白表達相對水平分別為3.78±0.12和2.39±0.08，與對照組6.08±0.19相比較，差異明顯（P＜0.01）（圖2～5）。

圖2 慢性束縛應激后大鼠前額葉皮質cAMP含量的變化

圖3 慢性束縛應激后大鼠前額葉皮質PKA 活性的變化

圖4 慢性束縛應激后大鼠前額葉皮質p－CREB表達水平的變化

圖5 慢性束縛應激后大鼠前額葉皮質BDNF表達的變化

3 討 論

應激性事件是人類抑郁癥的明顯促發因素，并且慢性、低強度、長期的日常壓力是引發抑郁的主要原因［6］。束縛制動作為一種較為純粹的挫折應激，具有軀體應激小，能夠較好地突出心理或情緒因素的特點，因此是一種較好的負性心理應激動物模型［4，5］。

與以往的研究結果相一致［7～9］，本實驗觀察到，與對照組相比應激大鼠第1 周出現體質量增長減少，隨著應激次數的增加，其體質量增加減少更為突出，這提示慢性束縛應激抑制大鼠體質量的增長。慢性束縛應激引起體質量增長減少的原因很多，其中皮質酮升高是一個重要原因。有研究發現腹腔注射皮質酮明顯抑制了大鼠體質量的增長［10］。皮質酮水平增高抑制體重增長可從皮質酮的生物學作用進行解釋，皮質酮促進蛋白質分解，抑制其合成，同時也影響了糖和脂類的代謝，最終導致體重增長緩慢。本研究發現，慢性束縛應激引起血漿皮質酮水平明顯升高。

大量研究表明，慢性應激時機體內穩態失衡，腦內可產生廣泛的神經化學及形態學改變，最終導致大腦器質性損害。很多研究顯示，轉錄因子環磷腺苷反應元件結合蛋白（CREB）與抑郁癥的發病機制和治療相關。強迫游泳引起大鼠海馬和前額葉皮質磷酸化細胞外信號調節蛋白激酶（p－ERK）和p－CREB分子水平的降低［11］。研究發現，慢性束縛應激明顯抑制了大鼠前額皮質磷酸化的ERK1／2 的表達。CREB是ERK 通路的下游分子，研究發現慢性溫和應激明顯抑制大鼠海馬齒狀回BDNF 蛋白的表達和CREB 的磷酸化［12］。BDNF 是一種主要的神經營養因子，在海馬和皮層中高水平表達，是神經元再生的關鍵因素［12］，BDNF的下調參與慢性應激對前額葉皮質損害。本實驗結果顯示，慢性束縛應激組大鼠前額葉皮質的cAMP 含量、PKA 活性、BDNF表達和p－CREB 含量較對照組明顯降低，在應激反應中cAMP－PKA－CREB－BDNF信號通路被抑制，提示cAMP－PKA－CREB－BDNF 信 號 通 路 可能參與應激發生的機制。

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