慢性束縛應激對大鼠體質(zhì)量、血清皮質(zhì)酮和前額葉皮質(zhì)cAMP－PKA－CREB－BDNF通路的影響

孟珊珊 劉洪文

抑郁癥是一種常見的精神障礙，它以情感病態(tài)變化（主要是情緒低落）為顯著特征。抑郁癥的發(fā)生與多種因素有關，其中很重要的一個因素就是機體持續(xù)暴露于應激條件下。盡管一定程度的應激是有益的。但是機體長時間處于應激狀態(tài)下會導致抑郁癥的發(fā)生［1～3］。不同的應激模型被用來研究應激反應的不同方面。慢性束縛應激作為一種慢性應激模型，已被廣泛的應用到應激相關的精神疾病基礎研究中［4，5］。慢性束縛應激模型是將動物持續(xù)暴露于不可逃避的束縛應激。本研究采用這種模型，觀察應激后大鼠的體質(zhì)量、血清皮質(zhì)酮和前額葉皮質(zhì)cAMP－PKA－CREB－BDNF通路的變化，為探索應激發(fā)生的分子病理機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Sprague－Dawley大鼠30只。體重180～200 g，購自哈爾濱醫(yī)科大學動物中心；大鼠購回后適應1周開始實驗，置于自然晝夜節(jié)律光照條件下，在標準潔凈的嚙齒動物籠內(nèi)飼養(yǎng)，墊料為木屑，每4 d更換1次，自由進食、飲水，每籠2～3只，控制室溫（22±2）℃；大鼠隨機分為3組：對照組、慢性束縛應激1周組和慢性束縛應激2周組，每組各10只。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 （1）對照組不做任何應激處理，僅在應激組應激階段禁水禁食；（2）慢性束縛應激組分別進行1周和2周慢性束縛應激；慢性束縛應激是將應激組大鼠置于有機玻璃制成的束縛管中，管壁鑿有直徑0.4 cm 的小孔，確保通風良好；大鼠在束縛管中有限的空間活動，但不會造成肉眼可見的軀體上的傷害；大鼠每日應激6 h（9：00～15：00），連續(xù)進行1周和2周，每日應激階段禁水禁食，應激結(jié)束后將其放回正常飼養(yǎng)的籠具中，此時可以自由飲水進食。

1.2.2 體質(zhì)量測量 所有大鼠均在應激前、應激1周和2周后用電子動物秤稱體質(zhì)量1次。體質(zhì)量增加量等于每周末體質(zhì)量減去每周開始時體質(zhì)量。

1.2.3 血清皮質(zhì)酮濃度測定 最后一次實驗結(jié)束后第2 d上午10：00～11：00，麻醉后處死大鼠，斷頭取血，置于離心管內(nèi)，室溫下4000 r／min 離心10 min，取上清液置－20℃冰箱保存，待測皮質(zhì)酮水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme－Linked Immunosorbent Assays，ELLISA）法測定皮質(zhì)醇濃度，操作步驟按照皮質(zhì)酮試劑盒說明書（DE3600，R＆D Systems，Inc）進行。

1.2.4 額葉皮質(zhì)cAMP 含量、PKA 活性和BDNF表達水平測定

將皮質(zhì)組織于4℃復溫，加入2 ml預冷50 mmol／L醋酸緩沖液（pH4.75），勻漿后靜置5 min，3500r／min離心15 min，收集上清液；60℃烘干后，4℃保存待測，采用放免法測定cAMP含量，ELISA法測定BDNF 表達水平（西唐生物公司）。另取皮層組織約50 mg，加入PKA 抽提緩沖液0.25 ml［25 mmol／L Tris－HCl（pH7.14），0.5 mmol／L EDTA，0.5 mmol／L EGTA，10 mmol／Lβ巰基乙醇，1μg／L亮肽素，1μg／L 抑肽酶］，冰浴上勻漿；將勻漿液傾入離心管中，4℃、3500 r／min離心5 min，吸取上清液，測定時按試劑盒（Promega公司）說明書步驟操作，酶活性單位為units／ml。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western－blotting） 各組大鼠在斷頭取血測血清皮質(zhì)酮濃度的同時，取雙側(cè)前額葉皮質(zhì)標本，冰上裂解、勻漿，取上清液；經(jīng)蛋白定量后聚丙烯酰胺凝膠（SDS－PAGE）電泳、蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移和膜封閉；封閉結(jié)束后分別用小鼠抗大鼠p－CREB抗體溶液、兔抗大鼠CREB 抗體溶液和小鼠抗大鼠β－actin抗體溶液室溫孵育，以上三種抗體均購自Sigma公司；二抗孵育后顯色、曝光、顯影及掃描免疫印跡條帶并進行分析。

1.2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組比較采用單因素方差分析（PostHoc LSD 法），各組自身前后比較采t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠體質(zhì)量的變化

第1周應激組大鼠體質(zhì)量增長［（35±11）g與對照組（59±16）g］相比明顯降低（P＜0.05）；第2周應激組體質(zhì)量增長［（23±8）g］明顯低于對照組［（68±14）g］（P＜0.05）（圖1）。

圖1 應激組與對照組大鼠體質(zhì)量增長比較與第1周對照組比較，＊P＜0.05；與第2周對照組比較，＃P＜0.05

2.2 大鼠血清皮質(zhì)酮水平的變化

對照組、束縛應激1周組和束縛應激2周組大鼠血清皮質(zhì)醇濃度分別為（198.21±101.35）ng／ml、（356.78±112.21）ng／ml和（558.49±98.32）ng／ml，應激各組均高于對照組（表1）。

表1 大鼠血清皮質(zhì)酮水平（ng／ml）

2.3 前額葉皮質(zhì)cAMP－PKA－CREB－BDNF 通路的變化

慢性束縛應激1周和慢性束縛應激2周組大鼠前額葉皮質(zhì)的cAMP 含量、PKA 活性和BDNF 表達水平顯著低于對照組，p－CREB 蛋白表達相對水平分別為3.78±0.12和2.39±0.08，與對照組6.08±0.19相比較，差異明顯（P＜0.01）（圖2～5）。

圖2 慢性束縛應激后大鼠前額葉皮質(zhì)cAMP含量的變化

圖3 慢性束縛應激后大鼠前額葉皮質(zhì)PKA 活性的變化

圖4 慢性束縛應激后大鼠前額葉皮質(zhì)p－CREB表達水平的變化

圖5 慢性束縛應激后大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達的變化

3 討 論

應激性事件是人類抑郁癥的明顯促發(fā)因素，并且慢性、低強度、長期的日常壓力是引發(fā)抑郁的主要原因［6］。束縛制動作為一種較為純粹的挫折應激，具有軀體應激小，能夠較好地突出心理或情緒因素的特點，因此是一種較好的負性心理應激動物模型［4，5］。

與以往的研究結(jié)果相一致［7～9］，本實驗觀察到，與對照組相比應激大鼠第1 周出現(xiàn)體質(zhì)量增長減少，隨著應激次數(shù)的增加，其體質(zhì)量增加減少更為突出，這提示慢性束縛應激抑制大鼠體質(zhì)量的增長。慢性束縛應激引起體質(zhì)量增長減少的原因很多，其中皮質(zhì)酮升高是一個重要原因。有研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射皮質(zhì)酮明顯抑制了大鼠體質(zhì)量的增長［10］。皮質(zhì)酮水平增高抑制體重增長可從皮質(zhì)酮的生物學作用進行解釋，皮質(zhì)酮促進蛋白質(zhì)分解，抑制其合成，同時也影響了糖和脂類的代謝，最終導致體重增長緩慢。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應激引起血漿皮質(zhì)酮水平明顯升高。

大量研究表明，慢性應激時機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，腦內(nèi)可產(chǎn)生廣泛的神經(jīng)化學及形態(tài)學改變，最終導致大腦器質(zhì)性損害。很多研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷腺苷反應元件結(jié)合蛋白（CREB）與抑郁癥的發(fā)病機制和治療相關。強迫游泳引起大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（p－ERK）和p－CREB分子水平的降低［11］。研究發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應激明顯抑制了大鼠前額皮質(zhì)磷酸化的ERK1／2 的表達。CREB是ERK 通路的下游分子，研究發(fā)現(xiàn)慢性溫和應激明顯抑制大鼠海馬齒狀回BDNF 蛋白的表達和CREB 的磷酸化［12］。BDNF 是一種主要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在海馬和皮層中高水平表達，是神經(jīng)元再生的關鍵因素［12］，BDNF的下調(diào)參與慢性應激對前額葉皮質(zhì)損害。本實驗結(jié)果顯示，慢性束縛應激組大鼠前額葉皮質(zhì)的cAMP 含量、PKA 活性、BDNF表達和p－CREB 含量較對照組明顯降低，在應激反應中cAMP－PKA－CREB－BDNF信號通路被抑制，提示cAMP－PKA－CREB－BDNF 信 號 通 路 可能參與應激發(fā)生的機制。

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