亞低溫治療對大鼠腦梗死后Bax和Bcl－2表達的影響

王玉凱 任 麗 陶恩祥

亞低溫可以降低腦缺血后細胞代謝率、減少細胞能量消耗、降低血管的通透性等減輕腦損傷后的腦水腫、降低顱內壓，有效降低腦代謝活動，促進神經功能恢復［1～4］，但亞低溫治療對缺血性腦損傷的保護作用的具體機制還不確定。本研究的目的通過急性腦梗死的大鼠模型，觀察亞低溫條件下Bax、Bcl－2的表達變化，探討亞低溫治療缺血性腦損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及分組

SPF級雄性健康SD 大鼠46只，由中山大學北校區動物實驗中心提供（體重280～330 g）。符合國家衛生部頒發的實驗動物清潔級標準（實驗動物質量合格證許可證號：SCXK（粵）2004－0011 粵監證號2008A010）。模型制備在中山大學北校區動物實驗中心完成（屏蔽動物實驗室使用證明編號：NO：0021275），手術場所及所用器具嚴格消毒，全部操作在無菌條件下進行。實驗期間大鼠飼養于中山大學北校區動物實驗中心，動物房光暗周期12 h。

根據隨機數字表將模型鼠隨機分為常溫組（normal temperature group，NT）10 只、亞低溫組（mild hypothermic group，HT）30只，亞低溫組又分3 h組、6 h組、12 h組，每組各10只。各實驗分組每一時間點每種檢測方法（TTC 染色和免疫組化）各選取5只大鼠用于觀察。

所有大鼠術前12 h 禁食，術前6 h 禁水，線栓法制作局灶性腦梗死模型［5］。常溫組大鼠手術過程中用電暖器維持肛溫在37～38℃，術后轉移到溫度為25 ℃的房間；亞低溫組大鼠分別在缺血后3、6、12 h采用噴灑酒精和電扇降溫的方法在10 min內使肛溫降至30 ℃（相應于腦溫33 ℃［6］），然后轉移到溫度為5 ℃的房間，在5 ℃的房間里維持大鼠肛溫在30 ℃［7］，缺血24 h后取材觀察。

假手術組（sham operation，SO）6 只大鼠：除不插魚線外，其余操作與模型組相同。術后把大鼠轉移到溫度為25℃的房間，每一時間點每種檢測方法（TTC染色和免疫組化）各選取3只大鼠用于觀察。

1.2 動物模型神經功能評分

根據Bederson評分標準［8］對各組動物模型在各時間點進行評分。

1.3 TTC 染色

3.5%的水合氯醛過量麻醉大鼠，快速取腦組織放入－20℃冰箱，待組織凍硬后進行冠狀位切片（片厚2 mm）；放入2%TTC（避光）染色30 min（37℃），4%多聚甲醛固定24 h后拍照。用圖像分析軟件測定每張腦片的面積和梗死面積，由梗死面積×切片厚度＝梗死灶體積，全腦面積×切片厚度＝全腦體積［9］，以梗死體積百分比＝（梗死灶體積／全腦體積）表示缺血后腦損傷的嚴重程度。

1.4 免疫組織化學

經灌注固定、梯度蔗糖脫水后，常規石蠟包埋，然后行冠狀位切片，片厚5μm，進行免疫組化檢測；一抗為兔抗Bcl－2、Bax、caspase－3（SANGA CRUZ產品），二抗為生物素化山羊抗兔IgG（Boster公司產品），每張切片于高倍鏡（400倍×）下梗死灶周邊區皮質和紋狀體的5個視野計數，取其平均數［10］。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 神經功能評分

假手術組大鼠不出現神經功能缺失的表現，評分為0；常溫組和亞低溫組大鼠術后出現不同程度局灶性神經功能缺損表現；亞低溫組大鼠神經功能缺損表現比常溫組輕，隨亞低溫治療開始時間的延后，神經功能缺損表現逐漸加重（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠神經功能評分（±s）

表1 各組大鼠神經功能評分（±s）

注：與NT 組比較，＊P＜0.05；與6 h、12 h組比較，△P＜0.05；與12 h組比較，▲P＜0.05。

指標 SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組神經功能評分 0 2.35±0.16 1.46±0.19＊△1.93±0.16＊▲2.12±0.17＊

2.2 腦梗死體積百分比

假手術組無腦梗死灶出現。亞低溫組腦梗死體積百分比明顯小于常溫組（P＜0.01）；亞低溫各組腦梗死體積百分比：3 h＜6 h＜12 h（P＜0.05）（表2）。

表2 各組腦梗死體積百分比（±s，%）

表2 各組腦梗死體積百分比（±s，%）

注：與NT 組比較，＊P＜0.05；與6 h、12 h組比較，△P＜0.05；與12 h組比較，▲P＜0.05。

指標 SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組腦梗死體積百分比 0 22.35±0.16 15.46±0.19＊△17.93±0.16＊▲20.13±0.17＊

2.3 免疫組織化學

2.3.1 Bax表達變化 Bax表達陽性細胞僅胞漿著色呈棕黃色。常溫組和亞低溫組Bax表達陽性細胞數較假手術組明顯增加。亞低溫組比常溫組Bax表達陽性的細胞數明顯減少（P＜0.05）。亞低溫各組Bax表達陽性細胞數：3 h＜6 h＜12 h（P＜0.05）（表3、圖1～4）。

2.3.2 Bcl－2表達變化 Bcl－2表達陽性細胞胞漿著色呈棕黃色。常溫組和亞低溫組Bcl－2表達陽性細胞數較假手術組明顯增加。亞低溫組比常溫組Bcl－2陽性細胞數增加（P＜0.05）。亞低溫各組Bcl－2表達陽性細胞數依次是3 h＞6 h＞12 h（P＜0.05）（表4、圖5～8）。

表3 各組Bax陽性細胞數的比較（±s，個／每個400倍視野）

表3 各組Bax陽性細胞數的比較（±s，個／每個400倍視野）

注：與NT 組比較，＊P＜0.05；與6 h、12 h組比較，△P＜0.05；與12 h組比較，▲P＜0.05。

指標 SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組Bax陽性細胞數 1.60±1.24 53.20±5.81 24.60±5.94＊△ 38.00±4.00＊▲ 46.00±7.58＊

表4 各組Bcl－2陽性細胞數比較（±s，個／每個400倍視野）

表4 各組Bcl－2陽性細胞數比較（±s，個／每個400倍視野）

注：與NT 組比較，＊P＜0.05；與6 h、12 h組比較，△P＜0.05；與12 h組比較，▲P＜0.05。

指標 SO 組 NT 組 HT3 h組 HT6 h組 HT12 h組Bcl－2陽性細胞數 2.40±1.14 21.60±5.94 43.20±5.81＊△ 35.10±4.31＊▲ 29.40±7.58＊

3 討 論

腦缺血后神經元的死亡有壞死和凋亡兩種，細胞凋亡參與缺血后梗死的發展。腦缺血后缺血中心區的神經元以壞死為主，缺血邊緣區即半暗帶區神經元則以凋亡為主。因此腦梗死后治療的一系列措施主要是針對缺血半暗帶進行的。亞低溫能夠縮小梗死面積、減輕腦水腫和改善缺血癥狀等，這些作用均可起到抑制神經元凋亡、阻止腦缺血后梗死灶進展的作用。

Bax是一種促凋亡蛋白，它表達增加可以促進細胞凋亡。Bcl－2是抗凋亡蛋白。二者存在于線粒體外膜、核膜和內質網膜上，可以形成不同的二聚體，通過它們之間的不同比例來調節線粒體膜的通透性，最終調節細胞的凋亡或存活。本研究結果顯示，腦缺血后Bcl－2和Bax表達均上調。Bcl－2／Bax比值下降，凋亡細胞數增加［11］，促進Bcl－2表達、抑制Bax表達可使Bcl－2／Bax比值增加，凋亡細胞數減少，起到腦保護作用［12～14］。

文獻報道，亞低溫可使缺血腦組織的Bax表達上調和Bcl－2表達下調，發揮腦保護作用［13～15］。本實驗發現Bax表達陽性細胞多位于缺血半暗帶區，亦即缺血壞死區和正常腦組織的交界區域，證實Bax參與缺血后細胞凋亡。本實驗結果顯示，亞低溫各組Bax表達陽性細胞數均明顯少于常溫組，說明亞低溫治療可使Bax的表達下調，提示亞低溫治療可能抑制或延緩了細胞凋亡。

亞低溫各組Bcl－2表達陽性細胞數均明顯多于常溫組，說明亞低溫治療使Bcl－2 表達上調而抑制凋亡。Bcl－2和Bax蛋白含量的比值決定細胞凋亡過程的發生，凋亡的神經元會同時出現Bax表達升高和Bcl－2表達降低［16，17］，隨著缺血時間的延長如果沒有新的刺激因素作用，Bcl－2表達降低，Bcl－2陽性細胞數減少。有實驗發現亞低溫治療12h、6h、3h組Bcl－2表達陽性細胞數呈遞增趨勢，說明早期亞低溫治療可抑制缺血半暗帶區細胞的凋亡，延緩腦梗死進一步發展。

本實驗結果顯示，亞低溫組缺血3h、6h和12h的梗死體積百分比依次增加，而亞低溫各組在相應時間點與常溫組比較梗死體積百分比均明顯縮小。說明腦缺血后早期亞低溫治療可縮小梗死體積的擴大。由此可以推測亞低溫治療可能延緩了腦梗死的進展，減輕缺血性腦損傷，也就是延長了臨床治療的時間窗。

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